核酸适体检测赭曲霉毒素A荧光方法的建立

桂海娈，金庆日，张亚军，王晓杜，杨永春，邵春艳，程昌勇，卫芳芳，杨 杨，杨梦华 ，宋厚辉

(浙江农林大学动物科技学院，浙江临安311300)

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是曲霉属和青霉属产毒菌株的次级代谢产物［1］，在被污染的食物和动物饲料中普遍存在，具有诱变性、免疫毒性、肾脏毒性和肝脏毒［2］。在香料、谷物、葡萄酒、动物饲料等农畜产品中都可检测到OTA 的存在［3］，并直接威胁人和动物的健康安全［4］。我国食品安全国家标准规定食品中OTA 限量为5 μg/kg，欧盟则规定牛奶、奶粉中OTA 限量为零。

目前我国检测OTA 主要依靠薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)［5］、酶联免疫吸附法(ELISA)［6］等。这些方法虽然具有特异性强、灵敏度高等特点，但使用的设备价格昂贵，样品处理繁琐，不适宜用于快速检测［7］，其中酶联免疫吸附法基于抗体识别抗原的特异性反应，对抗体试验要求较高，试验周期较长，易出现假阳性结果。

核酸适体(Aptamer)是一条约由20 ～100 个核苷酸组成的单链寡核苷酸片段，可与靶物质特异性结合，可通过指数富集配体系统进化技术，利用连续筛选方法获得［8］。当靶物质存在时，核酸适体在范德华力、碱基堆积力等作用下折叠形成特殊的三级结构与之结合［9］。与传统的抗体相比，核酸适体具有制备方便，易修饰，亲和力高，稳定性好等特点［10］，在生物传感器、荧光检测等方面得到广泛应用，如量子点法检测蛋白［11］，碳纳米管－核酸适体传感器［12］。现有核酸适体检测OTA 方法主要有:磁性纳米颗粒法［13］，电化学法［14］等。

本试验主要利用OTA 特异性核酸适体，利用荧光染料PicoGreen 对双链核酸的特异性结合原理，建立了一种检测OTA 的快速定量方法。PicoGreen 不结合单链核苷酸，仅识别并结合双链DNA 的螺旋沟，继而释放荧光［15］。特异性的核酸适体与OTA特异性结合后，多余、未结合OTA 核酸适体与互补链杂交生成双链 DNA。加入 PicoGreen 时，PicoGreen 识别溶液中的双链DNA。当PicoGreen 浓度一定时，反应体系中加入不同浓度的OTA，则反应液中的荧光强度不同，从而达到快速定量检测OTA 的目的。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 96 孔板(Costar 2592，Conning 公司);荧光检测仪(SynergyTMH1，BioTek 公司);超纯水仪(D11921，Thermo Fisher Scientific 公 司)。OTA、黄曲霉毒素B1、伏马毒素、桔毒素和玉米赤霉烯酮等真菌毒素(Sigma Aldrich 公司)溶于乙醇，4℃保存备用;PicoGreen(P7581，Life Technologies 公司)，初始浓度为200 ×。OTA 核酸适体序列［16］，OTA 核酸适体互补链序列DNA1 由生工生物工程上海股份有限公司合成(表1)。

表1 单链寡核苷酸名称与序列

1.2 试验方法

1.2.1 PicoGreen 检测杂交双链 各取50 μL 核酸适体与互补链DNA1(浓度均为10 nmol/L)于95℃加热5 min，冰浴10 min。将核酸适体与DNA1 混匀于25℃反应5 min［17］，加入10 μL PicoGreen 10 ×溶液避光反应，检测荧光强度(激发波长为480 nm，发射波长为520 nm)。本试验的缓冲液为:10 mmol/L Tris，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，20 mmol/L CaCl2(pH 8.5)［18］。

1.2.2 PicoGreen 与双链DNA 反应时间优化 取50 μL OTA 核酸适体与等体积浓度DNA1 于25℃反应5 min，再加入10 μL PicoGreen 10 ×，荧光检测仪内连续检测30 min。

1.2.3 OTA 敏感性试验 25 μL 20 nmol/L 核酸适体与50 μL 不同质量浓度的OTA 溶液在96 孔板内混匀，25℃反应20 min［19］。加入25 μL 20 nmol/L DNA1 溶液反应5 min 后，再加入10 μL PicoGreen反应，检测荧光强度。

1.2.4 OTA 核酸适体特异性试验 分别将25 μL 20 nmol/L 核酸适体与50 μL 不同毒素反应于25℃反应20 min，OTA、黄曲霉毒素B1、伏马毒素、桔毒素和玉米赤霉烯酮浓度均为0 ～200 μg/L。步骤同1.2.3。

1.2.5 检测样品试验 同时使用本试验非标记荧光法与ELISA 方法检测样品。在含1%啤酒溶液内添加OTA，其中20份样品内含有OTA，10份样品无OTA，OTA 浓度在两种方法的检测范围内。非标记荧光法:25 μL 20 nmol/L 核酸适体与50 μL 样品混匀反应，步骤同1.2.3。ELISA 操作方法:100 μL BSA－OTA(0.5 mg/L)于微孔板上4℃包被过夜，PBS洗涤3 次，加入200 μL 5%脱脂牛奶，25℃孵育1 h，PBS 洗涤3 次。检测样品溶液时，每孔加入100 μL 样品混合液(24.2 mg/ L 鼠抗－OTA 溶于样品溶液，体积比为1∶1)25℃孵育1 h，每孔再加入100 μL HRP－羊抗鼠IgG 25℃孵育1 h。每孔加入100 μL 显色液TMB 混匀后于37℃恒温箱内显色10 min，每孔加入100 μL H2SO4终止液混匀，检测OD450nm，根据制作的标准曲线计算样品中OTA 含量。计算两种检测法间的Kappa 值［20］。

2 结果与分析

2.1 检测原理 PicoGreen 是一种定量检测双链DNA，灵敏度可达到1 μg/L 级别的荧光染料。结合双链DNA 后，PicoGreen 荧光强度增大1000 倍以上，且不受单链DNA 的干扰。OTA 特异性核酸适体可识别并结合OTA(图1)。结合OTA 后，核酸适体空间构象会随之发生变化，不再与其互补链结合;未与OTA 结合的核酸适体可与其互补链杂交形成双链DNA。反应体系中微量双链DNA 可通过加入PicoGreen 放大荧光信号，检测荧光强度，确定样品中的OTA 浓度。

图1 OTA 荧光检测原理图

2.2 PicoGreen 检测核酸适体与互补链杂交产物双链DNA 检测表明，PicoGreen 检测核酸适体与互补链的杂交产物时荧光强度最大，与Tirs 缓冲液的荧光值相比，PicoGreen 本身无荧光;单链DNA(核酸适体、互补链)因自身形成少量二聚体产生微量荧光;PicoGreen 识别双链DNA 致荧光强度增大。因此，可用PicoGreen 检测双链DNA，核酸适体与互补链的杂交产物为双链DNA(图2)。

2.3 PicoGreen 与双链DNA 反应时间优化PicoGreen 被激发产生的荧光强度具有最大值。在核酸适体与其互补链反应体系中加入PicoGreen 后，PicoGreen 瞬间与双链DNA 结合，且在前3 min 随反应时间推移，荧光强度逐渐趋于稳定，说明PicoGreen 与双链DNA 结合已达到饱和(图3)。在特定PicoGreen 浓度下，双链DNA 越多，荧光强度越强，直到PicoGreen 完全结合双链DNA 为止;溶液中无双链DNA 时，荧光强度保持不变。因此，选择荧光值达峰值3 min 时为最适反应时间。

图2 PicoGreen 检测DNA

图3 PicoGreen 与双链DNA 反应时间优化

2.4 OTA 敏感性试验 随OTA 浓度增加，与OTA特异性结合的核酸适体越多，则核酸适体与互补链杂交生成的双链DNA 越少，PicoGreen 识别双链DNA 产生的荧光强度越弱(图4)。该法的最低检测限为1 μg/L(1 ppb)，线性范围为1 μg/L(1 ppb)～200 μg/L (200 ppb)，具有高灵敏度。

2.5 OTA 核酸适体特异性试验 为了确定OTA 核酸适体与PicoGreen 方法检测OTA 的特异性，在相同试验条件下，比较食品及饲料中常见黄曲霉毒素B1(AFB1)、桔毒素(CTN)、伏马毒素B1(FB1)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的检测结果(图5)。毒素浓度相同时，OTA 存在的反应体系中释放的荧光强度最弱，表明OTA 核酸适体已与OTA 特异性结合，不再与其互补链结合。因此，溶液内无双链DNA，PicoGreen 激发产生的荧光强度最弱。其他霉菌毒素不能结合OTA 核酸适体，所以反应体系中的核酸适体互补链可以结合核酸适体，产生双链DNA，并结合PicoGreen 释放出荧光。图5说明该核酸适体能够特异性识别OTA，与FB1，AFB1，CTN 或ZEN，且无交叉反应。

图4 OTA 敏感性试验

图5 OTA 核酸适体与PicoGreen 方法检测OTA 的特异性分析

2.6 核酸适体荧光检测方法与抗体ELISA 方法比较 为比较核酸适体荧光检测方法与抗体ELISA方法之间的一致性，试验对30份啤酒样品进行了检测(表2)。利用统计方法计算Kappa 值为0.857 ＞0.8(95%可信度)，两种方法的检测结果高度一致，本方法可用于样品检测。

表2 荧光法与ELISA 方法比较(+阳性;－阴性)

3 小结与讨论

OTA 主要污染谷物及其制品、牛奶等，严重危害人体和动物健康［21］。目前OTA 检测主要采用试纸条比色法和色谱分析法［22］，对检测样品前期处理要求较高，且抗体制备及保存成本较高。本试验建立的基于核酸适体与荧光染料PicoGreen 检测OTA的新方法，为霉菌毒素检测提供了新思路。

核酸适体是与抗体有相似功能的单链寡核苷酸，依靠特异性碱基识别、通过空间构象变化结合靶分子，已被广泛应用于检测领域。

本试验建立的检测方法，OTA 核酸适体特异性较强，与其他常见霉菌毒素无交叉反应。通过检测PicoGreen 识别双链DNA 激发产生的荧光峰值可减少外因干扰，实时反应溶液OTA 量。检测灵敏度为1 μg/L，与传统常用的ELISA 法相比高度一致，Kappa 值达0.857，可在45 min 内完成检测。检测方法特异性较强，灵敏度较高，具备快速、易操作等特点。

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