不同水平高血压患者血清Klotho蛋白、NO、ET-1的表达水平及相关性

张欢欢 韩 冰 廉银珠 赵慧颖 (吉林大学第一医院老年病科，吉林 长春 3002)

研究表明内皮素(ET)和一氧化氮(NO)参与高血压的发生和发展过程。Klotho作为新发现的抗衰老基因，研究表明其与体内多种血管活性物质相互作用，具有保护血管内皮、舒张血管、促进血管新生、抗动脉硬化等作用〔1〕。目前关于血清Klotho蛋白与血压水平及高血压发病机制的关系尚不明确。本研究旨在探讨不同程度高血压患者血清Klotho蛋白、NO、ET-1的表达与高血压的关系及其相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2011年8～11月在我院心血管疾病诊治中心住院患者96例及体检中心的健康对照者30例。入组时均经过询问病史、体格检查、X线检查、心电图、超声心动图检查、相关实验室检查等。采用水银柱血压计测量患者右侧上臂血压。将患者按血压水平分为对照组30例，收缩压(SBP)＜140 mm-Hg和舒张压(DBP)＜90 mmHg;高血压1级组31例，SBP 140～159 mmHg和(或)DBP 90～99 mmHg;高血压2级组33例，SBP 160～179 mmHg和(或)DBP 100～109 mmHg;高血压3级组32例，SBP≥180 mmHg和(或)DBP≥110 mmHg。入选标准:①年龄18～75岁。②符合第7版《内科学》定义的高血压标准。③血、尿、粪常规、肝、肾功能、电解质检测均正常。④既往有高血压，但未服药治疗或未规律服药治疗，现血压仍≥140/90 mmHg。排出标准:①患者既往有高血压病史，正在使用降压药物治疗，目前血压＜140/90 mmHg;②患有急慢性肝、肾疾病、肿瘤、冠心病、脑血管病、周围血管疾病、自身免疫性疾病、其他感染性疾病;③血、尿、粪常规、肝、肾功不在正常范围;④继发性高血压患者。各组间年龄及性别分布不存在显著性差异(P＞0.05)。见表1。

1.2 标本的采集 采集所有患者清晨空腹肘静脉血液3～5 ml，3 000 r/min离心10～15 min，吸取上清液于EP管密闭保存，-80℃冰箱保存待测。

1.3 试剂与方法 人血清Klotho蛋白、ET-1定量检测采用酶联免疫吸附(ELISA)法，试剂盒购于上海源叶生物科技有限公司。血清NO测定采用硝酸还原酶法，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。使用上海第三分析仪器厂提供的721分光光度计，按说明书提供的计算公式计算结果。应用生化自动分析仪检测空腹血糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等，均在我院检验科生化室完成。

1.4 统计学方法 应用SPSS20.0软件，计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，两变量之间关系采用Pearson线性相关或Spearman相关分析;计数资料组间比较采用χ2检验。

表1 各组间的一般情况(±s)

表1 各组间的一般情况(±s)

项目 对照组(n=30)高血压1级组(n=31)高血压2级组(n=33)高血压3级组(n=32)54.47±9.7 52.74±6.6 53.30±8.1 55.91±10.4男性〔n(%)〕 17(56.7) 16(51.6) 15(45.5) 15(46.9)空腹血糖(mmol/L)5.46±0.50 5.95±1.07 6.18±1.50 6.35±1.51 TG(mmol/L) 1.91±0.97 1.70±1.00 2.17±1.21 2.06±1.38 TC(mmol/L) 4.32±0.75 5.07±0.89 4.93±1.28 4.79±0.92 LDL-C(mmol/L)2.75±0.62 3.09±0.73 3.16±0.96 3.14±0.85 HDL-C(mmol/L)年龄(岁)(±s)0.11±0.29 1.37±0.34 1.21±0.34 1.16±0.40

图1 血清Klotho蛋白与NO水平之间的相关性

2 结果

2.1 各组Klotho蛋白、NO、ET-1水平比较 随血压水平升高，血清Klotho蛋白及NO水平逐渐降低，Klotho蛋白在高血压1级组与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)，余组间比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)，NO水平在任意两组间比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。ET-1水平随血压水平升高而逐渐升高，高血压3级组、2级组分别与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)，高血压3级组与1级组相比有显著性差异(P＜0.05)，余组间比较无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

2.2 血清Klotho蛋白、NO、ET-1含量分别与血压水平的相关性 随着血压水平升高，血清Klotho蛋白、NO含量逐渐降低，且均与血压水平呈负相关(r=-0.470，-0.813，均P＜0.000 1)。ET-1含量随血压水平升高而逐渐升高，与血压水平呈正相关(r=0.288，P＜0.01)。

表2 四组间Klotho蛋白、NO、ET-1水平比较(±s)

表2 四组间Klotho蛋白、NO、ET-1水平比较(±s)

与高血压1级组比较:1)P＜0.05;与高血压2级组比较:2)P＜0.05;与高血压3级组比较:3)P＜0.05

组别 n Klotho蛋白(pg/ml)NO(μmol/L)ET-1(μmol/L)对照组 30 146.82±20.52)3)65.1±12.81)2)3)176.44±37.72)3)高血压1级组 31 142.23±21.3 56.85±11.5 179.94±53.3高血压2级组 33 128.16±23.71) 45.03±6.171) 202.99±54.7高血压3级组 32 115.27±23.11)2)29.67±7.41)2)209.49±45.51)

2.3 血清 Klotho蛋白、NO、ET-1水平之间的相关性 采用Pearson检验，Klotho与ET-1之间无相关性(r=-0.154，P=0.086)，采用Spearman检验，发现Klotho蛋白与NO之间呈正相关(r=0.408，P＜0.000 1)，NO与ET-1之间呈负相关(r=-0.266，P=0.003)。见图1，图2。

2.4 Klotho蛋白与血糖间的相关性 Klotho蛋白与空腹血糖之间不存在相关性(r=-0.053，P=0.559)。

2.5 Klotho蛋白与血脂间的相关性 Klotho蛋白与TG、HDLC之间无相关性(r=-0.095，-0.018，均 P＞0.05)。Klotho蛋白与TC、LDL-C之间存在负相关(r=-0.182，-0.199，均P＜0.05)。见图3，图4。

图2 血清NO与ET-1水平之间的相关性

图3 血清Klotho蛋白与TC之间的相关性

3 讨论

目前认为血管内皮损伤是心血管疾病的重要病理生理基础〔2〕，研究〔3〕表明血管内皮功能障碍是高血压最早期和最重要的血管损害。VEC可合成多种血管活性物质，对血管平滑肌的收缩、舒张活动起调节作用，其中最重要的有ET-1和NO。ET-1是目前已知最强烈的缩血管活性多肽，其可作用于平滑肌细胞的ET受体A(ETA)，促进钙离子释放，增强细胞外的钙离子内流，使血管强烈收缩，从而导致外周血管阻力(SVR)升高〔4〕。NO是主要由NO合成酶(NOS)催化L-精氨酸生成，可使血管平滑肌细胞内钙离子浓度减低，导致血管舒张，引起SVR降低。此外，NO可抑制血管壁及循环血中的一些活性因子作用，发挥抑制血管平滑肌细胞增生、防止内皮损伤及动脉硬化形成等功能〔5〕。Klotho基因是由 Kuro-o等〔1〕发现的一种抗衰老基因，主要在肾脏和脑脉络膜高表达，动物实验证实Klotho基因的正常表达可抑制并逆转动脉硬化等病理生理过程，如降低血压、防止动脉内膜增厚及血管纤维化等。Aizawa等〔6〕首次报道了血清Klotho蛋白的浓度随高血压的发展而呈逐渐下降的趋势。

本研究结果可能是原发性高血压患者血清Klotho蛋白浓度降低，引起血管内皮功能障碍及动脉硬化，从而导致血压升高。随着血压水平升高，血管内皮功能障碍逐渐加重，使NO合成及分泌减少，导致血清NO水平逐渐降低。Mizuno等〔7〕研究发现长期高血压持续循环压力应激可导致自发性高血压大鼠(SHR)体内Klotho基因的表达下调。何亚军等〔5〕研究发现高血压组Klotho蛋白吸光度和NO水平较非高血压组明显降低。有研究报道血浆Klotho蛋白水平随年龄增加而降低〔5〕，本实验在除去年龄、性别等因素后，Klotho蛋白与血压水平仍呈负相关，推测内源性Klotho蛋白减少可能是高血压发生、发展的独立危险因素。本研究结果显示血清ET-1水平随血压水平升高而逐渐升高，与血压水平呈正相关，分析原因为当血压升高时，VEC损伤导致血管内皮功能紊乱，再生大量的ET-1，而引起血压持续升高。王国戗等〔8〕的研究显示血浆ET-1水平与高血压分级呈正相关，与本实验研究结果一致。

图4 血清Klotho蛋白与LDL-C之间的相关性

本研究分析了Klotho蛋白、NO、ET-1三者的相关性，分析其原因为血压升高时内源性Klotho蛋白分泌减少，且血压升高导致VEC功能障碍引起NO合成及释放减少，而ET-1的合成及释放增多。Saito等〔9〕的动物实验证实Klotho基因缺陷可引起NO合成减少，并发现Klotho基因的正常表达可改善血管内皮功能，增加NO的产生，降低血压，防止内膜增厚和血管纤维化。何亚军等〔5〕研究指出Klotho蛋白可能通过调节NO的含量维持血压稳定。根据目前研究结果，推测Klotho蛋白可能通过改善内皮功能、调节内源性NO释放途径调节血压，但Klotho蛋白调节NO释放的具体机制有待进一步研究。有假说认为Klotho蛋白可能通过调节NOS的活性来调节NO的释放。研究发现NO可通过下调血管紧张素(Ang)Ⅱ1型受体基因表达，使AT 1-R数目下调而抑制血管平滑肌细胞的增殖，从而抑制ET-1分泌〔10〕。当Klotho蛋白水平下降，NO水平随之下降，解除对ET-1的抑制作用，ET-1合成及释放增多。田鹏等〔11〕研究发现Klotho和ET-1呈负相关。而本实验研究未发现Klotho蛋白与ET-1之间存在相关性，可能与样本量较小有关。

Aizawa等〔6〕的研究发现高血压患者血清Klotho蛋白的浓度与血清TC呈负相关，本研究结果与其一致。推测Klotho蛋白可能参与了血脂代谢调节。国外有研究提示Klotho基因的多态性与脂代谢存在相关性〔12〕。刘晓林等〔13〕研究表明Klotho基因G-395A SNP、F352V SNP与高血压及血脂有相关性。故对Klotho基因多态性的研究可能有助于早期发现及诊治高血压、脂代谢紊乱高危人群。

综上所述，监测Klotho蛋白、NO、ET-1水平可能对今后高血压的防治、预后判断具有指导意义。目前国内有研究显示福辛普利能够上调Klotho的表达〔14〕，故那些能够调节Klotho基因启动子活性、上调Klotho蛋白表达的物质，无疑将成为治疗高血压的新途径。

1 Kuro-o M，Matsumura Y，Aizawa H，et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing〔J〕.Nature，1997;390(6655):45-51.

2 Sadik NA，Mohamed WA，Ahmed MI.The association of receptor of advanced glycated end products and inflammatory mediatom contributes to endothelial dysfunction in a prospective study of acute kidney injury patients with sepsis〔J〕.Mol Cell Biochem，2012;359(1-2):73-81.

3 陆再英，钟南山，谢 毅，等.内科学〔M〕.北京:人民卫生出版社，2011:252-4.

4 Pelosi G，Emdin M，Carpeggiani C，et al.Impaired sympathetic response before intradialytic hypotension:a study based on spectral analysisof heart rate and pressure variability〔J〕.Clin Sci，1999;96(1):23-31.

5 何亚军，苏显明，王新阳.Klotho蛋白在高血压发病中的作用〔J〕.西安交通大学学报(医学版)，2010;31(4):434-6.

6 Aizawa H，Saito Y，Nakamura T，et al.Downregulation of the Klotho gene in the kidney under sustained circulatory stress in rats〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1998;249(3):865-71.

7 Mizuno I，Takahashi Y，Okimura Y，et al.Upregulation of the klotho gene expression by thyroid hormone and during adipose differentiation in 3T3-L1 adipocytes〔J〕.Life Sci，2001;68(26):2917-23.

8 王国戗，杨彩玲，郭丽娟.不同血压水平人群血管危险因子检测及其临床意义探讨〔J〕.检验医学，2014;29(3):254-7.

9 Saito Y，Nakamura T，Ohyama Y，et al.In vivo klotho gene delivery protects against endothelial dysfunction in multiple risk factor syndrome〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;276(2):767-72.

10 梁伟钧，李果明，陈建英.高血压病患者血浆内皮素和一氧化氮含量的变化及其意义〔J〕.广东医学院学报，2004;22(4):337-8.

11 田 鹏，汪 汉，李 璐，等.Klotho基因对自发性高血压大鼠内皮功能的影响〔J〕.生物医学工程学杂志，2011;28(3):526-30.

12 Shinoyama Y，Tak IK，Mitsuda Y，et al.KLOTHO gene polymorphisms G-395A and C 1818T are associated with low-density lipoprotein cholesterol and uric acid in Japanese hemodialysis patients〔J〕.Am JNephrol，2009;30(4):383-8.

13 刘晓林，马厚勋.Klotho基因3个SNP位点与老年高血压及脂代谢的相关性〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(23):3429-32.

14 李湘民，周巧玲.福辛普利对自发性高血压大鼠脑超微结构及Klotho基因表达的影响〔J〕.中国动脉硬化杂志，2010;18(4):273-8.