红景天苷诱导小鼠肝癌细胞凋亡作用的机制

宋汉君 吕少春 李丽疆

(佳木斯大学基础医学院人体解剖学教研室，黑龙江 佳木斯 154007)

红景天苷具有调节免疫、抗衰老、抗疲劳、抗抑郁等作用〔1～3〕。研究显示，红景天苷能抑制肝癌细胞(HepA)增殖，具有提高特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和非特异性杀伤细胞(NK)的活性〔4〕，但尚未进一步研究红景天苷抗肿瘤作用机制。本试验旨在分析红景天苷诱导小鼠HepA肝癌细胞凋亡和作用机制，对肿瘤细胞凋亡抑制基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)进行测定，为红景天苷的抗癌机制研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品和试剂 苏木精、伊红购于北京中杉金桥生化试剂公司;DNA末端转移酶缺口末端标记法(TUNEL)原位凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物技术有限公司;免疫组化试剂盒、浓缩对二氨基联苯(DAB)显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司;兔抗鼠Bcl-2、Bax单克隆抗体购于Santa Cruz生物公司;红景天苷购于上海微晶生物试剂公司;环磷酰胺(CTX)购于江苏恒瑞医药股份有限公司;

1.1.2 试验动物和细胞株 KM普通级小白鼠30只，雌雄各半，体重(20±2)g，购于佳木斯大学实验动物中心，动物合格证号:SLXK(黑)20110001。分笼饲养，每笼10只，室温(26±2)℃，均食用普通饲料，自由饮水，清洁级动物饲养房，光照8～10 h/d。HepA荷瘤种鼠，佳木斯大学细胞生物学实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠HepA肝癌模型 无菌条件下取传代接种的种鼠HepA腹水瘤，以0.9%生理盐水稀释至5×106/ml，然后接种于实验小鼠左腋下，0.3 ml/只。

1.2.2 试验分组及药物处理 试验小鼠随机分为三组，每组10只，24 h后，对照组给予生理盐水灌胃0.2 ml/只，1次/d;CTX作为阳性药物对照组(CTX组)，1次/d，25 mg/kg，腹腔注射;红景天苷组(Sa组)每只小鼠腹腔注射红景天苷溶液0.3 mg/d，连续注射 28 d。

1.2.3 观察凋亡形态学变化 28 d后，脱颈处死各组小鼠，无菌迅速解剖出各组小鼠肿瘤组织，于甲醛中固定，酒精脱水，石蜡包埋，组织切片，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察肿瘤组织形态学变化。

1.2.4 TUNEL染色 石蜡切片脱蜡水合，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，加入蛋白酶K，PBS漂洗，浸入封闭液，PBS漂洗2次，标记反应。样本用滤纸吸干，每个样品滴加末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)反应60 min，PBS漂洗3次，样品用滤纸吸干。滴加辣根过氧化酶(HRP)工作液，反应30 min，滴加DAB工作液，显色10 min，PBS漂洗3次，苏木精复染，漂洗脱水，镜下观察。镜下棕黄色颗粒即为凋亡细胞，而蓝色细胞提示非凋亡细胞，计算阳性细胞百分数。选择5个随机视野，计算凋亡指数。

1.2.5 免疫组化检测 Bcl-2、Bax应用免疫组化试剂盒对Bcl-2和Bax的表达进行检测。镜下棕黄色细胞为蛋白表达阳性的细胞，蓝色细胞为阴性细胞，计算5个随机视野阳性细胞百分数。

1.3 统计学方法 应用Origin7.5软件进行分析，试验数据以x±s表示，计量资料经方差齐性检验为方差齐性，多组资料采用单因素方差分析，两组间差异采用Duncan＇s检验。

2 结果

2.1 红景天苷对肿瘤细胞凋亡形态学的影响 HE染色光镜下显示，对照组肿瘤细胞排列紧密，大小不一，形状各异，胞核大且深染，具有明显异型性。CTX组和Sa组细胞数目明显减少，核染色质聚于核膜边缘，核型不规则，核碎裂，出现凋亡小体，与对照组相比出现较多的凋亡细胞。见图1。

2.2 TUNEL染色检测细胞凋亡指数 TUNEL染色光镜下可见，对照组肿瘤细胞多染成蓝色，即阴性细胞。而在CTX组和Sa组出现了更多的棕黄色颗粒。经图像分析，CTX组〔(8.89±0.88)%〕、Sa组〔(20.16±3.14)%〕与对照组 〔(4.88±0.62)%〕肿瘤细胞凋亡指数比较差异有统计学意义(P＜0.01)。见图2。

2.3 肿瘤细胞Bcl-2、Bax蛋白表达情况 CTX组和Sa组Bcl-2阳性表达显著降低(41.91±7.46，27.47±5.23)，与对照组(69.50±8.36)差异显著(P＜0.01)。而 Bax阳性表达经过 CTX(43.52±7.45)和 Sa(52.78±9.06)处理后，与对照组(23.79±4.21)差异显著(P＜0.01)。见图3，图4。

图1 肿瘤细胞凋亡形态学变化(×400)

图2 HepA肝癌细胞凋亡形态学变化(×200)

3 讨论

通过红景天苷诱导小鼠HepA肝癌细胞凋亡的上述系列试验结果表明，红景天苷能诱导小鼠肿瘤组织出现明显的细胞凋亡形态学改变，增加肿瘤细胞凋亡数目，减少了Bcl-2增加Bax的表达，这表明红景天苷抗小鼠HepA肝癌的作用与其诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。

本实验通过HE染色、TUNEL染色提示肿瘤细胞DNA大量断裂，证明红景天苷可诱导小鼠HepA肝癌细胞凋亡。细胞凋亡过程涉及多种基因的激活、表达与调控，如Bcl-2、半胱胺酸蛋白酶(caspase)、原癌基因(c-myc)、p53 等〔5，6〕。凋亡过程的紊乱与肿瘤等许多疾病的发生有直接或间接的联系。许多化疗药物如紫杉醇、长春新碱等，能够诱导肿瘤细胞凋亡，药物诱导肿瘤细胞凋亡已成为抗肿瘤的一个重要策略。

线粒体凋亡途径和细胞表面死亡受体介导的凋亡途径是导致细胞程序性死亡的两个主要途径。而线粒体凋亡途径被公认为一个主要的途径，由Bcl-2家族蛋白介导(Bcl-2和Bax)，该蛋白在宫颈癌、肝癌、胃癌等肿瘤中出现高表达，本实验结果推测，红景天苷可通过启动肿瘤细胞线粒体凋亡途径引起细胞凋亡。

本试验以小鼠为试验对象，但是否可以在其他动物模型或人体中出现同样的试验结果目前还未曾可知，这是今后需要进一步研究的方向。

图3 肿瘤组织Bcl-2蛋白的表达(×100)

图4 肿瘤组织Bax蛋白的表达(×400)

1 Green DR，Evan GI.A matter of life and death〔J〕．Cancer Cell，2002;1(1):19-30.

2 Mlejnek P.Caspase inhibition and N6-benzyladenosine-induced apoptosis in HL-60 cells〔J〕．J Cell Biochem，2001;83(4):678-89.

3 Reed JC.Mechanisms of apoptosis〔J〕．Am JPathol，2000;157(5):1415-30.

4 Evan GI，Vousden KH.Proliferation，cell cycle and apoptosis in cancer〔J〕．Nature，2001;411(6835):342-8.

5 Takahashi A，Masuda A，Sun M，et al．Oxidative stress-induced apoptosis is associated with alterations in mitochondrial caspase activity and bcl-2-dependent alterations in mitochondrial pH〔J〕．Brain Res Bull，2004;62(6):497-504.

6 Muller PA，Vousden KH.p53 mutations in cancer〔J〕．Nat Cell Biol，2013;15(1):2-8.