不同类型水稻品系苗期和全生育期耐盐性鉴定与分析

谢留杰，段 敏，潘晓飚，唐兴国，朱长志，黄善军

(浙江省台州市农业科学研究院 作物研究所，浙江 临海 317000)

世界上约有20%的农业用地受到盐碱化的影响［1］，中国有3 630万hm2的盐碱地。近年来，高温气候的频发和地下水的不断枯竭又加重了土壤盐碱化的趋势。水稻是中度盐敏感作物，在盐碱土地上生长受抑制，如遭遇恶劣天气甚至造成绝收。因此，挖掘和利用耐盐的种质资源，培育出适应当地气候条件下的耐盐品种，对于高效利用盐碱地和粮食稳产具有重要意义。筛选耐盐资源是培育耐逆品种的关键，科研工作者对多种农作物展开耐盐研究，鉴定一些耐盐作物［2-6］。王建飞等［7］认为0．8%的NaCl浓度适合筛选耐盐材料，而0．5%的NaCl浓度可兼顾其他基因型的表达;吴其褒等［8］采用在沿海滩涂用海水灌溉的方法，对从俄罗斯引进的104份水稻种质资源进行了苗期耐盐性鉴定;孙公臣等［9］选用不同类型和地区的6个水稻品种在大田条件下人工加盐进行品种耐盐性试验;潘晓飚等［10］对水稻全生育期进行盐胁迫，以产量性状作为标准鉴定优异种质。目前，国内外研究人员大多分别研究水稻苗期或成熟期耐盐性，将两个不同生育时期耐盐性综合分析的鲜有报道。

植物对盐胁迫的适应性主要有3个机制:对渗透压的适应;排除钠离子或氯离子;对钠离子和氯离子的适应性［11］。由于盐害反应的多样性及耐盐机制的复杂性，植物耐盐的准确作用机理仍然不清楚。随着遗传学和基因组学的发展，研究者通过QTL作图和转录组分析，分离和鉴定出许多耐盐相关基因［12-16］。其主要分为4类功能:运出Na+而保持K+含量不变;控制胞内物质的合成直接提高耐盐性;调控耐盐基因的表达间接增加植物耐盐能力;增加水稻气孔的关闭程度和气孔的数量和密度［17］。利用这些克隆的基因，已有研究者通过转基因手段提高了植物的耐盐性［18］。耐盐基因的鉴定多数通过同源克隆得到，继而利用过量表达来分析其是否与盐胁迫相关。水稻的遗传多样性丰富，不同品种的遗传背景复杂，耐盐机制也不尽一致。耐盐基因的研究对象一般1～2个品系，对于盐敏感度存在差异品系间的研究尚未报道。

本研究选用20个不同类型的水稻品系，分别在苗期和全生育期进行盐胁迫试验，对2个时期的多个盐胁迫指标进行考察分析，同时选取5个不同盐敏感度的品系，分析盐处理后胁迫相关基因表达，旨在筛选出营养和生殖生长兼顾耐盐性的优异种质，同时为水稻耐盐性机制深入研究提供依据。

1 材料方法

1．1 材料

选取不同类型的20个水稻品系，包括5个常规粳糯稻品种:秀水09、徐稻4号、镇稻88、台糯1号、白壳糯;3个籼稻骨干恢复系:明恢63、9311、密阳46;2个盐敏感的日本粳稻品种越光、日本晴;2个粳稻保持系:浙 4B、加 B;8 个粳型恢复系材料:粳恢 1722、K1457、K6093、HR145、HT38、HT58、HT98、HT236。

1．2 方法

1．2．1 苗期盐胁迫试验 试验于2013年5—6月在浙江省台州市农科院进行。选取饱满干净种子浸种2 d，30℃催芽后，播在96孔PCR塑料板上，保持湿度，待幼苗长至2 cm高度，加复合肥培养至3～4叶进行盐胁迫处理。试验选用3个盐浓度(0．0%，0．5%，0．8%NaCl水溶液)进行处理，3次重复，每个品系12株。处理期间为保持盐浓度的稳定，每天补充丧失的水分。胁迫7d后，选取5株幼苗测量苗高。再挑选3株分离茎叶和根部，茎叶放置于95℃烘箱内烘干至恒质量，根系烘干后测定钠钾离子含量。钠钾离子测量采取硝化液浸提法。

1．2．2 全生育期海水灌溉胁迫试验 试验于2013年6—11月在三门县头岙村进行。所有材料经浸种催芽后，6月12日直播于秧板田上，试验设置2个重复，每个品种20株，行间距20 cm。正常田间水肥管理下生长至2叶1心后，灌溉以淡水调配成盐浓度为0．5%的海水进行胁迫处理。成熟后，以正常水田条件为对照(同时期种植在台州市农科院临海小溪试验基地)，考察主要农艺性状表现。

1．2．3 胁迫相关基因的表达分析 水稻幼苗培育:选择K1457、秀水09、密阳46、日本晴和9311共5个不同耐盐能力的品种进行高盐胁迫下胁迫相关基因的表达分析。取饱满的水稻种子，用0．3% 次氯酸钠溶液消毒15 min，30℃浸种催芽至露白，播于96孔塑料板中，于光照培养箱(16 h光照/8 h黑暗)中培养至3叶期，温度设定为28℃光照/23℃黑暗，营养液使用国际水稻研究所推荐配方［19］。胁迫处理前28℃连续光照培养两天，处理过程亦处于全光照环境。处理时将水稻幼苗置于含150 mmol/L NaCl的水稻营养液中，于处理后0，12，24 h取地上部，每个样品包含3株幼苗，液氮速冻后保存于－80℃冰箱中用于RNA提取及荧光定量PCR分析。

水稻幼苗总RNA提取采取Trizol法提取步骤完成。总RNA提取后经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析并进行浓度检测，符合要求的RNA于－80℃保存备用。cDNA第一链的合成参照Fermants公司反转录系统的操作手册进行。

1．3 鉴定指标及数据分析

1．3．1 苗期耐盐指标 主要包括盐害级别、茎叶干物质质量、苗高和根系钠钾离子比值。

盐害级别参照Gregorio［20］的鉴定标准:1级(75%以上叶面积绿色);2级(50% ～75%叶面积绿色);3级(25% ～50%叶面积绿色);4级(少于25%叶面积绿色);5级(植株完全死亡，或者接近死亡)。

根系钠钾离子比值测定:选3株幼苗的根部，烘干后磨碎，放置于2 mL离心管内，加入硝化液1．5 mL(1 mL浓硫酸、5 mL浓硝酸和0．5 mL 60%三氯乙酸比例配置)，90°水浴5 min，10 000 r/min离心4 min，取上清100μL加水稀释至1 mL，每个样品3个重复，混匀后用乙炔火焰分光光度计测量钠钾离子含量。

1．3．2 全生育期耐盐指标 主要有单株产量、每穗实粒数、每穗总粒数、单株穗数、株高、结实率、穗长和千粒质量。

1．3．3 盐胁迫后基因的表达量变化 方法是以水稻18S rRNA基因为内参，设计基因特异引物，依照Roche公司Fast Start Universal SYBR Green Master(ROX)操作说明进行实时定量RT-PCR实验。实验结果采用2－ΔΔCT法进行数据分析，计算公式如下:

1．3．4 数据分析 数据分析采用Excel 2007和SPSS 19．0统计软件。盐浓度和品种作为2个固定因子，相对值经反正弦换算后分析，方差计算用多因变量方差分析，采取LSD和Duncan进行多重比较，分析浓度和品种之间的差异性。

2 结果与分析

2．1 盐胁迫对水稻幼苗生长的影响

盐处理1 d后，随着幼苗细胞内盐浓度增加，叶片气孔关闭，清晨“吐水”受到抑制;0．8% 浓度处理2 d后出现叶片黄化、干枯等盐害症状，0．5% 浓度处理3～4 d后部分品系也出现明显盐害特征。

不同浓度NaCl处理后，水稻茎叶干质量、苗高随着盐胁迫浓度的升高下降，而根系钠钾比则显著升高(表 1)。具体来看，对照、0．5%和 0．8%NaCl浓度处理下，茎叶干质量分别为 0．200，0．143，0．111 g;苗高为 24．7，24．5，22．3 cm;根系钠钾比分别为 0．307、1．110 和 5．110。

表1 不同浓度盐胁迫下水稻幼苗各性状显著性分析Tab．1 Significant analysis of different traits of rice seed ling under salinity stress

多重比较表明:除苗高外，0．5%NaCl浓度处理下水稻幼苗的耐盐指标与对照的差异均达极显著水平;0．8%NaCl浓度处理下，茎叶干质量、苗高和根系钠钾比3个性状值与其它处理间均达极显著差异。

2．2 不同水稻品系的苗期耐盐性评价

在0．8%盐浓度处理2 d后，HR145、日本晴和白壳糯等品系开始出现新叶卷曲、叶尖发黄，并随着处理时间增加逐渐叶片干枯、颜色发黄直至死亡;0．5%浓度处理下，水稻幼苗3 d后才出现盐害，且直至最后未出现植株死亡。由表2可看出，0．5%浓度处理下，12个品系的苗高超过CK;0．8%浓度处理下，苗高均未超过CK，但相对值大都超过0．85。盐害级别、根系钠钾比和茎叶干质量在2个浓度处理下增加或递减趋势明显，可将这3个性状作为幼苗耐盐能力的有效评价指标。品系浙4B、徐稻4号和HT98盐害级别均值最高;相对茎叶干质量随处理浓度增加而下降，浙4B、加B、HT38和HT58损失较少，2个浓度下均超过0．65，而HT98、K6093和K1457这3个品系则下降至0．50以下。所有试验品系中，K1457、HT58和加B的根系钠钾比均值较低，密阳46、HR145和徐稻4号根系钠钾比总体均值最高。K6093和明恢63在0．8%浓度处理下的相对茎叶干质量反而高于0．5%浓度处理。这可能是不同品种的盐胁迫应激反应之间的差异造成，也显示出耐盐机制十分复杂，仍需做进一步研究。

综合分析不同浓度下苗期盐害级别、根系钠钾比和相对茎叶干质量3个指标，加B、HT58是耐盐品系，而徐稻4号、HT98对盐较为敏感。

表2 盐胁迫对水稻幼苗盐害级别、根系钠钾比、茎叶干质量和苗高的影响Tab．2 Salinity damaged rating，Na+/K+，dry weight of shoot and p lant height of rice seedlings under salinity stress

2．3 全生育期盐胁迫对水稻主要农艺性状的影响

在全生育期盐胁迫条件下，参试的20个水稻品系均出现不同程度的盐害症状，品系间的差异明显。主要表现苗期叶片黄化、植株矮小和分蘖减弱，抽穗期有白化穗现象，部分品系穗分化受到严重影响甚至绝收。感盐品种越光在苗期大都已经死亡，成熟期只有几个单株有少量结实;日本晴、浙4B和HR145成熟后茎叶均枯黄，籽粒充实度差;K1457、镇稻88和加B等品系仍保持一定的长势，相对其它品系产量损失较少。有2个品系表现出特异的生长特性，密阳46苗期叶片枯萎，产量受影响，后期出现大量侧生分蘖，因温度等原因未能结实;明恢63前期出现大量枯死分蘖，但后期有返青苗出现，且能正常结实。

从成熟期的考种结果来看，水稻的单株产量、每穗实粒数、每穗总粒数、单株穗数、株高、结实率、穗长和千粒质量等8个重要农艺性状均受到抑制，与正常水田生长相比，有不同程度的下降(图1)。其中以单株产量和有效穗的损失最多，其相对值为4．2%和16．6%;而千粒质量和穗长则下降幅度较小，相对值为85．5%和83．2%。

图1 全生育期盐胁迫对主要农艺性状的影响Fig．1 Effect on main agronomic traits in whole plant growth duration under salt stress

2．4 不同水稻品系盐胁迫相关基因的表达差异

选择5个不同类型的代表品系进行试验，在150 mmol/LNaCl处理12 h、24 h后，4个盐胁迫相关基因(OsPSC5、OsLea3、OsDERB1A、OsDREB2A)的表达量受到不同程度的抑制或诱导。OsLea3(后期发育富集蛋白关键酶基因)对盐胁迫最为敏感，所有水稻品系均上调表达，部分品系24 h后表达量增至300倍以上;OsPSC5(脯氨酸合成关键酶基因)和OsDREB2A(非生物胁迫相应转录因子)在盐处理12 h后，两个基因表达量与0 h相比都有明显降低或增加，24 h后基因的表达又较12 h有一定的下降;Os-DERB1A在盐胁迫后，所有品系的表达均受到下调，24 h后抑制作用更加明显。

在试验的5个代表品系中，K1457成熟期的单株产量相对值最高，苗期的根系钠钾离子比值最低，诱导24 h后，其4个基因表达量处于所有品系的最低水平;密阳46苗期根系钠钾离子比值最高，盐处理后，其4个基因的表达量处于最高水平;盐敏感品种日本晴胁迫基因的表达规律与耐盐品种K1457类似，除了OsDERB1A外，所有基因均保持了较低的表达水平，且12 h后表达量趋于稳定。从图3可以看出，所有基因在盐胁迫处理后都快速响应，并在24 h后表达量有所下降。

3 讨论与结论

水稻在幼苗期(2叶1心)和孕穗期对盐表现出较高的敏感性［21］。农业研究者对苗期一般采用形态指标结合生理指标考查的方法［7，16-17］，通常包括盐害级别、苗高、干物质量、钠钾比等。相比之下，苗期的盐害级别易受到主观因素影响，而干物质积累和钠钾比分别体现耐盐的外和内的耐盐本质。成熟期耐盐指标主要为农艺性状的考查［8-10］，如单株产量、单株穗数、每穗总粒数、每穗粒数和千粒质量等，其中以单株产量作为重要经济性状更符合育种者需求。本研究在盐害级别等4个指标考查苗期品系耐盐性，结果表明在不同浓度处理下，除苗高外，其它3个性状各浓度之间差异显著;在成熟期选取了单株产量、单株穗数等8个指标，全生育期胁迫后各性状受到抑制，尤其以单株产量和单株穗数下降最多。

国内外科研工作者对两个盐敏感时期的水稻耐盐性鉴定进行了大量研究［7-10］，有报道［22］显示苗期和分蘖期有部分遗传重叠，但也有研究表明两者之间并无必然联系［23-24］。本研究选取了20个类型各异的水稻品系，考查了苗期和全生育期盐害相关的形态指标、生理指标和经济性状指标，品系间耐盐性表现各异，不同时期品系的耐盐性差异明显。苗期和全生育期盐胁迫的耐盐结果显示:两个不同时期的耐盐性并没有表现必然联系，如苗期0．8%浓度盐处理下，相对茎叶干物质积累并不低的品种浙4B(0．833)、日本晴(0．635)和HR145(0．525)，其全生育期盐处理后茎叶出现严重的干枯症状，成熟后产量损失较多。水稻中报道了许多耐盐相关的基因和转录因子，它们大都通过合成胞内物质(脯氨酸、可溶性糖等)或调控耐盐基因表达来提高植物耐盐能力［25-26］。作者选取了2个胁迫基因和2个转录因子对5个水稻品系进行诱导表达分析［13-15］。根据全生育期或苗期的耐盐指标鉴别出不同盐敏感类型品系，这些品系在受到盐胁迫后表达量之间并没有规律性的变化。一些盐敏感品系如日本晴的表达和耐盐品系类似，胁迫后OsPSC5、OsLea3、OsDREB2A的表达也处于较低的水准。由此可推断出，这些基因参与盐胁迫信号途径，但并不决定品种的耐盐性(表达量差异与盐敏感无必然联系)，其功能是盐害后的被动保卫细胞，并不是主动提高植物对盐的耐受性。

苗期0．5%NaCl盐胁迫试验下苗高与对照相比无显著性差异，而根系钠钾离子比值和相对茎叶干质量可作为有效鉴定指标。结合全生育期耐盐指标的考查，鉴定出5品系在2个生长时期表现均衡。4个盐胁迫相关基因在盐处理后，快速诱导响应，但其表达量增减与品种的耐盐性并无必然关系，推断其作用是被动参与保卫细胞。水稻不同生育时期的耐盐性之间无必然联系。因此，综合苗期和全生育期耐盐性鉴定，挖掘新的耐盐种质资源，鉴定和分离耐盐的主效基因，对高效创建强耐盐水稻中间材料及耐盐育种具有积极意义。

［1］邓绍云，邱清华．中国盐碱土壤修复研究综述［J］．北方园艺，2011(22):171-174．

［2］刘雅辉，王秀萍，张国新，等．棉花苗期耐盐生理指标的筛选及综合评［J］．中国农学通报，2012，28(6):73-78．

［3］穆俊丽，李建科，杨静慧，等．不同油葵品种种子萌发期的耐盐性研究［J］．北方园艺，2009(5):26-30．

［4］孙璐，周宇飞，汪澈，等．高粱品种萌发期耐盐性筛选与鉴定［J］．中国农业科学，2012，45(9):1714-1722．

［5］刘永惠，沈一，陈志德，等．不同花生品种(系)萌发期耐盐性的鉴定与评价［J］．中国油料作物学报，2012，34(2):168-173．

［6］沈一，刘永惠，陈志德，等．花生幼苗期耐盐品种的筛选与评价［J］．花生学报，2012，41(1):10-15．

［7］王建飞，陈宏友，杨庆利，等．盐胁迫浓度和胁迫时的温度对水稻耐盐性的影响［J］．中国水稻科学，2004，18(5):449-454．

［8］吴其褒，胡国成，柯登寿，等．俄罗斯水稻种质资源的苗期耐盐鉴定［J］．植物遗传资源学报，2008，9(1):32-35．

［9］孙公臣，赵庆雷，陈峰，等．几个水稻品种的耐盐性鉴定试验［J］．山东农业科学，2011，6(24):25-29．

［10］潘晓飚，黄善军，陈凯，等．大田全生育期盐水灌溉胁迫筛选水稻耐盐恢复系［J］．中国水稻科学，2012，26(1):49-54．

［11］Munns R，Tester M．Mechanisms of salinity tolerance［J］．Annu Rev Plant Biol，2008，59:651-681．

［12］Dai X，Xu Y，Ma Q，et al．Over expression of an R1R2R3 MYB gene，OsMYB3R-2，increases tolerance to freezing，drought，and salt stress in transgenic Arabidopsis［J］．Plant Physiology，2007，143:1739-1751．

［13］Claudia O，Silva-Ortega a，Ana E．Salt stress increases the expression of P5CSgene and induces proline accumulation in cactus pear［J］．Plant Physiology and Biochemistry，2008，46:82-92．

［14］Duan J，CaiW．OsLEA3-2，an abiotic stress induced gene of rice plays a key role in salt and drought tolerance［J］．PLoS ONE，2012，7(9):e45117．

［15］Joseph G D，Yoh S．OsDREB genes in rice，Oryza sativa L．，encode transcription activators that function in drought-highsalt-and cold-responsive gene expression［J］．The Plant Journal，2003，33(4):751-763．

［16］Ren ZH，Gao JP，Li LG，etal．A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter［J］．Nature Genetics，2005，37(10):1141-1146．

［17］Huang X Y，Chao D Y，Gao JP，etal．A previously unknown zinc finger protein，DST，regulates droughtand salt tolerance in rice via stomatal aperture control［J］．Gene Dev，2009，23(15):1805-1817．

［18］郭龙彪，薛大伟，王慧中，等．转基因与常规杂交相结合改良水稻耐盐性［J］．中国水稻科学，2006，20(2):141-146．

［19］Yoshida S．Forno D A，Cock JH，et al．Laboratorymanual for physiological studies of rice［R］．Los Banos，the Philippines:The International Rice Research Institute，1976．

［20］Gregorio G B，Senadhira D．Rapid screening for salinity tolerance in rice［C］//Proceedings of the 2nd Asian Crop Science Center，1995:758-759．

［21］章禄标，潘晓飚，张建，等．全生育期耐盐恢复系在正常灌溉条件下性状表现及耐盐杂交稻的选育［J］．作物学报，2012，38(10):1782-1790．

［22］Zang JP，Sun Y，Wang Y，et al．Dissection of genetic overlap of salt tolerance QTLs at the seedling and tillering stages using backcross introgression lines in rice［J］．Sci China Life Sci，2008，51(7):583-591．

［23］Foolad M R，Lin G Y．Absence of a relationship between salt tolerance during germination and vegetative growth in tomato［J］．Plant Breeding，1997，116:363-367．

［24］Zaidem M L，Mendoza R D，Tumimbang E B，et al．Genetic variability of salinity tolerance at different growth stages of rice［C］//PBGB2003 Annual Report．LasBanos，Philippines:IRRI，2004:19-20．

［25］Lin H X，Zhu M Z，Yano M，et al．QTLs for Na+and K+uptake of the shoots and roots controlling rice salt tolerance［J］．Theor Appl Genet，2004，108:253-260．

［26］Asano T，Hakata M，Nakamura H，et al．Functional characterisation of OsCPK21，a calcium dependent protein kinase that confers salt tolerance in rice［J］．PlantMol Biol，2011，75:179-191．