RNAi靶向抑制p65基因对大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化的影响*

赵二义，贾延吉力，王带媚，文国强，关文娟，景黎君，邓益东△

(1.海南省人民医院神经内科，海口 570311;2.郑州大学第一附属医院神经内科，河南 郑州 450052)

骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)可向多种细胞分化，在细胞转向分化的过程中可能存在多条信号通路，如Notch、Sox、Wnt等通路通过信号联系网络，启动信号重组、整合后，引领分化方向。核因子-κB(nuclear factor-kappa B)是细胞增殖与凋亡的重要调控因子，通过结合特异性序列调控多种基因的表达。p65蛋白是其重要的亚单位，由p65基因在细胞核内表达后转移至胞浆内，与另一个核因子-κB亚单位p50结合成p50/p65异源二聚体，胞浆内的 NF-κB抑制蛋白(IκB)与p50/p65结合，而抑制NF-κB活性。研究表明，NF-κB信号参与调控神经干细胞(neural stem Cell，NSCs)增殖、分化及凋亡等命运［1］，在 MSCs向神经元分化过程中，NF-κB 核移位受抑制［2］，而 MSCs与NSCs具有许多相似性，因此，理论上NF-κB信号也可能参与MSCs增殖、分化及凋亡调控。然而，目前采用RNAi技术下调NF-κB信号通路中的p65亚单位来研究其对MSCs增殖、分化的影响尚无相关报道。本研究初步探讨RNAi靶向抑制p65基因，对MSCs的增殖、分化及凋亡的影响，并研究MSCs向神经元分化的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由海南省中国热带农业科学院实验动物中心提供2～3月龄健康的Wistar大鼠，雌雄不限，体重150～250g，饲养条件符合清洁级标准，实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。

1.2 主要试剂

DMEM培养基及胎牛血清(美国Gibco公司);兔抗大鼠p65、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元微管结合蛋白(MAP-2)和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)等多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);FITC荧光标记的山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天公司);自 Qiagen公司采购大鼠的 Rn-p65-siRNA、Cy3标记的阴性对照Negative Control siRNA、转染试剂HiPerFect;RNeasy Mini试剂盒及QIAGEN OneStep RT-PCR试剂盒;四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Sigma公司);法舒地尔(天津红日药业股份有限公司);胰蛋白酶等实验试剂均为进口分装或国产分析纯。由上海生物工程公司根据设计合成大鼠的p65及β-actin引物，序列见表1。

Tab.1 Sequences for primer

1.3 MSCs培养及分组

取Wistar大鼠，颈椎脱臼处死后，75%乙醇浸泡5 min，在无菌条件环境中分离大鼠两侧股骨，剪开股骨两端，以含10%胎牛血清的DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，用1 ml无菌注射器反复吹打，制成细胞悬液，以2×106cells/ml的细胞密度直接种于25 cm2的塑料培养瓶中，放置在37°C、50ml/L的CO2恒温培养箱内培养，待贴壁细胞完全融合后，以含0.04%EDTA/0.25%胰蛋白酶消化传代，按1×105cells/ml的密度接种。每隔72 h换液，连续传代培养至少6代以上，随后将MSCs细胞悬液冻存在液氮中备用。取培养第6代以上的MSCs复苏后，用完全培养基(DMEM+15%胎牛血清+谷氨酰胺0.5 mol/L)充分沉淀混匀MSCs后，按每孔接种2×106个细胞至12孔培养板，放置在37°C、50ml/L的CO2恒温培养箱内培养2～3 d，选择细胞融合度达50%～70%时进行转染，效果最佳。将培养的骨髓间充质干细胞分为未转染组、转染组及阴性对照组3组，6孔/组。

1.4 siRNA转染MSCs

参照本室的实验方法［3］，MSCs的融合度达50% ～70%，参照Qiagen公司的细胞转染实验操作步骤，转染细胞。具体操作方法如下:吸取培养基1100μl(DMEM培养基+10%胎牛血清+双抗)加入培养板中，置于37°C、50ml/L的CO2恒温培养箱内孵育。同时，分别吸取 DMEM培养基100μl溶解300ng Rn-p65-siRNA 和 negative control siRNA，再吸取HiPerFect转染试剂6μl，充分混匀;置于室温孵育10min;再将转染复合物均匀加入含MSCs孔中，每孔中的siRNA的浓度要达到20nmol/L，放置在37°C、50ml/L的CO2恒温培养箱内孵育24～72 h。未转染组不转染siRNA，其培养条件与转染组及阴性对照组相同。Cy3标记的阴性对照Negative Control siRNA转染24h、48 h、72 h后在倒置荧光显微镜下观察MSCs的荧光表达，评价细胞转染效率。

1.5 siRNA转染MSCs后检测

1.5.1 四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法 采用MTT比色检测法，将各组的MSCs根据转染前、后各个相同时间点，均匀移入96孔板，每孔加入50μl MTT(5.0mg/ml)，置于37°C、50ml/L 的 CO2恒温培养箱内孵育 4h，每孔再加入 200μl二甲基亚砜(DSMO)，继续孵育至结晶崩解，取空白孔调零，利用酶标仪测定每个孔的吸光度值(波长490nm)，细胞存活率=细胞组A均值/空白组 A均值 ×100%。

1.5.2 RT-PCR法 利用RNeasy Mini试剂盒提取各实验组的MSCs的RNA，运用RT-PCR检测实验组MSCs内p65 mRNA表达变化情况。按照QIAGEN®OneStep RT-PCR试剂盒的操作步骤行RTPCR，50μl反应体系，10μl 5 × Buffer，2μl dNTP Mix，2μl QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix，10μl 5 × Q-Solution，10U RNase inhibitor，1.0μg RNA，0.6μmol/L引物。扩增参数:50℃逆转录30min，95℃生成15 min，94℃变性1 min，58℃ 退火1 min，72℃ 延伸1 min，总共进行30～35个循环，再72℃延伸10min。吸取10μl RT-PCR 产物 +2.0μl样缓冲液，滴入2%琼脂糖凝胶上行电泳，通过自动凝胶成像系统，将电泳结果拍摄保存，分析各目的基因与β-actin基因条带光度值。

1.5.3 Western blot印迹 取各组的MSCs，用100μl细胞裂解液裂解、变性、离心，留取上清蛋白质标本，利用分光光度法对蛋白质进行定量分析。取蛋白裂解液加凝胶缓冲液进行SDS-PAGE胶电泳，电泳之后，将蛋白质转至硝酸纤维素膜。取出膜后在室温条件下用封闭液(山羊血清)封闭3 h，然后加入一抗p65蛋白兔抗多克隆抗体(工作浓度分别为1∶200～300)，4℃孵育过夜，二抗(工作浓度为1∶10000)，37℃孵育60～120min，DAB 显色检测棕黄色条带。结果转膜后丽春红染色进行校正，照相记录结果，Quantity One软件分析图片灰度值。

1.6 体外诱导MSCs分化为神经元

1.6.1 诱导方法 按照前期实验的细胞诱导法［4］，将各实验组培养72 h后的MSCs行诱导实验。用D-Hank’s液清洗 MSCs 3遍，加诱导液(由DMEM液体培养基+10%胎牛血清+200μmol/l法舒地尔混匀调制)，置于37°C、50ml/L的CO2的条件下诱导6 h。将MSCs置于倒置显微镜下观察诱导前后细胞形态学演变。采取细胞免疫组化法检测诱导前后神经元特异蛋白NSE、MAP-2、GFAP的变化。

1.6.2 细胞形态学观察 倒置显微镜下动态观察MSCs诱导分化前后形态学变化

1.6.3 细胞免疫组化染色法 用PBS清洗各组细胞，随后取4%多聚甲醛的固定液在4℃环境中固定20min，0.2%Triton X-100处理 10min，封闭液(10%胎牛血清)封闭1 h。分别使用一抗兔抗p65多克隆抗体(2μg/ml)、兔抗 NSE多克隆抗体(1μg/ml)、兔抗 MAP-2多克隆抗体(1μg/ml)及兔抗GFAP 多克隆抗体(1μg/ml)，4℃ 孵育 24h。取PBS清洗3次后，在室温条件下用FITC标记的山羊抗兔IgG(1∶500)行染色标记、观察。利用倒置荧光显微镜拍摄(×200)细胞图像。各组均采集≥30个区域的细胞。尽量保证明视野下所采集的每张图像都含相同的细胞数。采取双人双盲法随机统计阳性细胞百分比例。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 siRNA转染MSCs

2.1.1 荧光观察 Cy3标记的negative control siRNA对照组MSCs荧光表达，随着转染时间延长，荧光表达逐渐增强。转染MSCs 24h开始出现部分红色荧光，转染率为28.2% ±4.3%;48 h后荧光表达明显增多，转染率为63.5% ±3.4%;72 h后荧光表达最强，转染率可达83.3% ±3.8%(图1A、B及C)。

2.1.2 各组MSCs存活率变化 MTT结果表明，转染前各组细胞存活率无统计学意义，转染后24h，Rn-p65-siRNA转染组MSCs的存活率显著下降，与未转染组及阴性对照组MSCs比较有统计学差异(P＜0.05)。转染48 h和72 h后存活率虽然较24h有所上升(P＜0.05)，但仍明显低于未转染组及阴性对照组MSCs，与未转染组及阴性对照组的MSCs的MTT比较仍有统计学意义(P＜0.05，表2)。

2.1.3 各组MSCs的p65 mRNA的表达变化 RTPCR结果显示，各组的MSCs转染前均可见p65 mRNA表达;转染24h后，Rn-p65-siRNA转染组的MSCs表达p65 mRNA开始显著减少，持续至72 h;与此同时，未转染组及阴性对照组p65 mRNA表达无明显变化(表3)。

2.1.4 各组MSCs的p65蛋白表达的变化 Western blot印迹检测显示，转染前各组均可见p65蛋白表达，转染24h p65蛋白下降，以转染72 h最显著;未转染组和阴性对照组中无此现象(表4)。

2.2 体外诱导MSCs分化为神经元

2.2.1 细胞形态观察 未转染组及阴性对照组MSCs向神经元分化速度较慢，诱导2～3 h细胞胞体开始收缩，呈锥形，折光性差，诱导4～5 h后部分细胞胞体收缩成圆形或多角形，部分胞体可观察到光晕，突起细长，部分细胞的突起交织成网络。Rnp65-siRNA转染组MSCs向神经元分化速度快，诱导1 h后胞体开始收缩，细胞间隙拉大，可见粗大突起，少部分交织成网，诱导2～3 h后，绝大多数细胞胞体收缩成圆形或锥形，立体感强，可见细长的细胞突起，部分交织成网络结构，可见少许细胞脱落、死亡。诱导6 h后，可见神经元样细胞明显增多，形成典型神经网络(图2A)。

2.2.2 各组神经元蛋白表达的变化 细胞免疫组化染色法诱导6 h后各组神经元蛋白表达结果显示，与未转染组及阴性对照组比较，转染组蛋白表达显著的增高(P＜0.05);未转染组、阴性对照组及转染组的GFAP表达率均小于1%，无显著性差异。与未转染组及阴性对照组比较，转染组P65的表达 显著下降(P＜0.01，表5，图2B、C、D、E)。

Tab.2 Values of MTT in each set of MSCs(%，，n=10)

Tab.2 Values of MTT in each set of MSCs(%，，n=10)

*P＜0.05 vs non-transfected group;#P＜0.05 vs negative control group

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Tab.3 Values of p65 mRNA in each set of MSCs(，n=10)

Tab.3 Values of p65 mRNA in each set of MSCs(，n=10)

*P＜0.05 vs non-transfected group;#P＜0.05 vs negative control group

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Tab.4 The values of p65 protein in each set of MSCs(，n=10)

Tab.4 The values of p65 protein in each set of MSCs(，n=10)

*P＜0.05 vs non-transfected group;#P＜0.05 vs negative control group

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Tab.5 Results of immunocytochemistry staining in each group 6 h after induction(%，，n=10)

Tab.5 Results of immunocytochemistry staining in each group 6 h after induction(%，，n=10)

NSE:Neuron-specific enolase;MAP-2:Neuronal microtubule-associated protein-2;GFAP:Glial cells fibrillar acidic protein*P＜0.05 vs non-transfected group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs negative control group

Group NSE MAP-2 GFAP P65 Non-transfected 62.0±1.3 60.2±2.5 ＜1 61.2±2.3 Negative control 61.3±0.5 60.6±1.8 ＜1 60.5±1.8 Transfected 83.5±1.2*#81.2±2.2*# ＜1 32.8±4.2＊＊##

Fig.1 Fluorescence expressed on MSCS tranfected by Cy3 labeled negative control siRNA(bar=100μm)

Fig.2 Induce MSCs of transfected group into neurons expression of NSE and MAP-2(6 h after induction，bar=100μm)

3 讨论

MSCs是一种具多种分化潜能的细胞，可向成骨细胞、脂肪细胞、胰岛细胞及神经元等细胞分化。研究发现骨髓间充质干细胞在神经损伤、修复过程具有保护作用，可能机制包括可向神经元分化，分泌相关神经营养因子，促进血管再生及抑制免疫反应［5］。Notch、Rho 和 mTOR 信号通路参与调节MSCs向神经元分化进程，适度调节信号通路活性，可提高 MSCs向神经元分化效率［4，6］，在 MSCs向神经元分化中可能牵涉多条信号重组、整合及引导分化方向，反映MSCs分化机制的复杂性。有研究发现MSCs向神经细胞分化过程中，伴随NF-κB核转位受抑制［2］，据此，推测 NF-κB 信号可能在 MSCs增殖、凋亡、分化等生命活动中起着重要作用。本研究发现，转染Rn-p65-siRNA，MSCs的p65 mRNA表达逐渐减少，当转染72 h，p65基因沉默率最高，p65蛋白表达最弱，与转染Cy3标志negative control siRNA转染72 h荧光表达最强基本一致，这提示转染72 h后，NF-κB信号最弱，是MSCs诱导分化最理想时机。因此，本研究选择在转染72 h后，选取各组细胞进行诱导分化，研究NF-κB信号在调控细胞分化的作用。转染Rn-p65-siRNA后，p65蛋白表达减弱，提示 NF-κB信号抑制，且 MTT检测发现 MSCs的凋亡率逐渐增加，72 h后凋亡率最高，与其它实验组比较有显著统计学意义，结果与NF-κB受抑制后神经干细胞凋亡增加现象类似［7］。MSCs凋亡率增高的可能机制:(1)NF-kB信号受抑制后抗凋亡基因表达下调，细胞抗凋亡作用减弱。(2)NF-κB信号受抑制导致细胞周期蛋白D1表达减少，引起细胞增殖能力下降。因此，推测 NF-κB信号在MSCs增殖、凋亡等命运其中重要作用。

神经干细胞分化涉及到信号级联反应，不同的转录因子的活化，决定细胞分化的方向，已有研究发现白介素-6(IL-6)及睫状神经营养因子介导激活NF-κB通路，可促进神经干细胞向星形胶质细胞分化［8］。相反，在成神经瘤细胞诱导分化的研究中发现，胞核内的NF-κB信号传导受抑制可抑制神经分化［9］。在脑室下层神经干细胞研究中发现，骨形成蛋白可促进神经干细胞向神经元分化，骨形成蛋白信号介导的神经干细胞分化具有剂量依赖性，而NF-κB可以正向调节骨形成蛋白［10］，提示神经干细胞向神经元分化过程非常复杂，可能牵涉到多种细胞因子共同作用，但对NF-κB信号在MSCs向神经元分化的机制了解较少。本研究采取小RNA干扰技术，转染Rn-p65-siRNA，阻断NF-κB信号通路，并采用法舒地尔诱导细胞分化，观察细胞分化效率。本研究发现，转染组MSCs诱导后细胞可高表达NSE、MAP-2，但表达 GFAP很少。结果表明阻断NF-κB信号后，MSCs向神经元分化效率显著增高，而未转染组及阴性对照组MSCs未观察到此现象，因此，推测MSCs分化过程中也可能涉及多种转录因子作用，多个信号级联反应，启动MSCs分化方向，而其中抑制NF-κB信号可能更有利MSCs向神经元方向分化，可能存在以下原因:(1)法舒地尔可能通过抑制Rho/ROCK通路，启动间充质干细胞分化进程，调节细胞骨架形成［11］;阻断NF-κB 信号，抑制细胞向胶质细胞分化［8］。因此，联合抑制 Rho/ROCK和NF-κB信号，可从不同信号级联反应途径促进MSCs向神经元方向分化。(2)NF-κB信号与Rho/ROCK信号可能存在协同作用(cross-talk):1)本实验中发现抑制NF-κB信号并没有引起MSCs向神经元样细胞分化，但加入法舒地尔诱导后，MSCs可以向神经元样细胞高效分化;2)在小鼠单核巨噬细胞实验中，显示NF-κB与RhoA GTP酶存在协同作用［12］;3)卵巢肿瘤细胞实验中发现Rho激酶抑制剂可抑制NF-κB信号［13］。据此推测这两条不同的信号途径之间可能存在协同作用，通过抑制Rho/ROCK信号传导，可能从旁侧途径调节NF-κB信号，从而更有利于MSCs向神经元分化。

综上所述，本研究发现NF-κB信号参与大鼠MSCs的增殖、凋亡及分化等生命活动，抑制p65基因转录，调节p65蛋白表达，阻断NF-κB信号传导，有利于提高MSCs向神经元样细胞分化效率。

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