罗布麻浸膏微生物限度检查方法的验证

闹闹尔再　杜尔再

【摘要】 目的：应用试验验证罗布麻浸膏微生物限度检查的方法。方法：选用平皿法与培养基稀释法测定该药品对5株验证菌的回收率，同时验证控制菌（大肠埃希菌）的检验方法。结果：5株人工污染菌的回收率均达到70%以上，符合验证要求。结论：该方法有效排除了样品抑菌作用的干扰，适用于罗布麻浸膏的微生物限度检查。

【关键词】 罗布麻浸膏；微生物限度检查；验证试验

【中图分类号】R927.11【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）08-0035-02

罗布麻浸膏曾用名为罗布麻霜，收载于《国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准》，具有祛痰、降血压、止咳、降血脂、抗菌消炎、抗衰老等功效[1]。其作用效果显著，尚未见毒副作用。由于罗布麻浸膏具有明显的抑菌作用，采用常规的微生物限度检查方法不能反映出样品被微生物污染的情况，因此选择合适的方法除去自身既有的抑菌作用才能进行微生物限度检查。为了确定该药品的抑菌活性及检验方法的可靠性，本文按照微生物限度检查法的现行标准（《中国药典》2010年版一部）的相关要求[2]，制定了罗布麻浸膏的微生物限度检查法，验证结果表明检验方法简便易行、准确、可靠，为同类药物的微生物限度检查提供了科学的试验依据。

1儀器与材料

1.1仪器（见表1）

1.2培养基及试剂（见表2）

1.3供试品罗布麻浸膏（新疆尉犁县金兴甘草制品有限公司）。

1.4试验用菌株（见表3）

以上菌株均为第三代，由新疆维吾尔自治区食品药品检验所提供。

2方法学验证与结果[2]

2.1菌液制备方法分别取适量枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌（ECO）、金黄色葡萄球菌（sau）标准菌株，转移至10ml灭菌后的营养肉汤中，恒温（37℃）下培养18～24h；取白色念珠菌（cal）适量，接种于改良马丁培养基中，在25℃下恒温培养24～48h。分别取1ml上述培养物，置于盛有加9ml的0.9%无菌NaCl溶液的试管中稀释使为10-5～10-7的菌悬液[2]。

将黑曲霉培养物转移在改良马丁琼脂培养基上，25～28℃培养7d，用3ml 0.9%无菌NaCl溶液洗脱孢子，之后取1ml孢子液，倒入9ml的0.9%无菌NaCl溶液中稀释使为10-5～10-7的孢子悬液[2]。

2.2供试液制备取样品10g，置锥形瓶中，加无菌NaC-蛋白胨缓冲液（pH7.0）至100ml，4000r/min振摇5min，使充分溶解混匀，便可（1∶10）。

2.3细菌、霉菌及酵母菌检查方法的验证

2.3.1试验组①平皿法：取“2.2”项下的供试液1ml，及各“2.1”项下的五种试验菌，分别注入平皿中，迅速倒入45℃完全溶化的相应培养基20ml，为减少误差每株菌平行制备2个平皿，待冷凝后，置所需温度下倒扣培养至规定的时间，观察计数。②培养基稀释法：取0.2ml“2.2”中的供试液/皿，每皿加入验证菌各10-5～10-7，其余方法同平皿法。

2.3.2菌液组不添加供试液，分别取“2.1”项下的五种试验菌，操作方法同试验组测定所加入的试验菌数。

2.3.3供试品对照组不加试验菌之外，其余方法同试验组，测定供试品本底菌数。平皿法与培养基稀释法各菌回收率试验结果见表4。

2.4大肠埃希菌检查方法的验证取供试液（1∶10）10ml及1ml10-5～10-7大肠埃希菌，接种在预先制备好的100ml胆盐乳糖培养基（BL）中，于37℃下恒温培养24h，观察培养基澄清度的变化；之后取浑浊管中的培养物适量做荧光反应与靛基质试验。另取培养物划线接种于MacC平板上，恒温（37℃）培养24h后观察其菌落的生长形态特征[2]。同时取金黄色葡萄球菌替代大肠埃希菌，其余操作方法同试验组。结果见表5。

3讨论

从表4结果可以看出，罗布麻浸膏经常规平皿法验证可以使人工污染的黑曲霉菌、大肠埃希菌和白色念珠菌的回收率在80%～99%，提示该药品对以上菌株无抗菌作用或抗菌作用很弱，回收率的结果满意（规定大于70%），证明平皿法可用于该药物的霉菌及酵母菌数检查。表4中还可知，罗布麻浸膏对枯草芽孢杆菌非常敏感，完全被抑制，回收率仅为0；而对金黄色葡萄球菌较敏感，回收率为44%～55%，说明罗布麻浸膏对细菌的生长繁殖有一定的抑制作用，不能采用常规法测定细菌数，必须改用其它的方法消除自身对细菌的抑制作用。但罗布麻浸膏对细菌的抑制作用不是很强，本试验选用了培养基稀释法。实验结果显示，每皿0.2ml，可基本去除抑菌成分对细菌生长的影响，回收率均大于70%。为此，培养基稀释法（每皿0.2ml）可用于罗布麻浸膏的细菌数检查。

从表5可知，在控制菌的验证中，试验组MUG呈现荧光，MUG阳性，靛基质试液液面呈玫瑰红色，结果检出大肠埃希菌；阴性菌对照组结果为未生长（表示未检出金黄色葡萄球）。故控制菌（大肠埃希菌）用常规方法检查。

通过方法验证试验，罗布麻浸膏的微生物限度检查可采用培养基稀释法（0.2ml/皿）测定细菌数；霉菌及酵母菌数采用平皿法测定；控制菌检查采用常规法即可达到效果。

参考文献

[1] 国家药典委员会.国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准（第11册）[M].国家药品监督管理局，2002：76-77.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国中医药科技出版社，2010：附录79-88.

（收稿日期：2015.01.26）