荭草的体外抗肿瘤活性研究

张玲艳　高翔　王晓玲

【摘要】目的：筛选荭草的抗肿瘤活性部位。方法：采用CCK8法观察荭草各提取部位对人肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞株生长的影响情况。结果：荭草的乙酸乙酯部位对人肺癌A549及肝癌HepG2细胞的生存率降至49.16%及57.44%；正丁醇部位对人肺癌A549及肝癌HepG2细胞的生存率降至39.18%和46.57%，呈现时间-剂量效应关系。结论：荭草对人肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞增值具有一定的抑制作用，是具有开发前景的抗肿瘤中藥。

【关键词】荭草；CCK8法；体外抗肿瘤；活性部位

【中图分类号】R285.5【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）08-0033-02

荭草为蓼科植物红蓼Polygonum orientale L.的干燥地上部分，具祛风除湿、清热解毒、活血、消积止痛之功，用于治疗风湿痹痛、头痛、心胃气痛、小儿疳积等症[1]。其主要成分为黄酮类化合物[2]，且该成分有显著抑制肿瘤细胞增殖的作用[3]。文献报道荭草对一些肿瘤细胞具有抑制作用，红蓼的果实、茎叶也有一定的抗肿瘤作用[4-6]。本研究采用CCK8法，初步探讨了荭草醇提液的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位对人肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞体外活性的抑制情况，为荭草的进一步研究及临床抗肿瘤的开发提供实验依据。

1仪器与材料

1.1仪器酶标仪（美国，Thermo Scientific Multiskan FC）；二氧化碳培养箱（美国，Thermo Fisher）；倒置相差显微镜（德国，徕卡DM500/DM750显微镜）；96孔培养板（美国Corning公司）；电子分析天平（瑞士，梅特勒-托利多公司）；Mill-Q型超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2材料 荭草采自天津经济开发区，经天津中医药大学张坚鉴定为荭草Polygonum orientale L.的地上部分；胰蛋白酶、1640高糖培养基、胎牛血清为美国GIBCO公司；CCK8试剂盒为碧云天生物有限公司；其他试剂皆为分析纯；水为由Mili-Q超纯水；人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。

2方法

2.1供试品制备称取荭草100g粉碎至60目，用3倍体积的60%的乙醇回流提取三次，每次1h，合并提取液，减压回收溶剂得浸膏。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，回收溶剂，减压回收，得石油醚、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取部位。冷冻干燥呈粉末，精密称取不同提取部分干燥粉末，用培养基制成10mg/ml母液，过0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃备用。

2.2细胞培养将细胞接种于含10%胎牛血清100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的1640培养液中，放置37℃、5%CO2培养箱中培养，实验细胞采用对数生长期细胞。

2.3CCK8法检测细胞存活率选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液后，将细胞密度调整为5×104个/ml，每孔接种100μl的细胞悬液于96孔培养板中，置于5%CO2及饱和湿度下的培养箱内37℃培养12 h。每孔加入不同萃取部位药物稀释液，使其终浓度分别为50、100、150μg/ml，每组5个复孔，对照组加入相同体积培养基，置于37℃、5%CO2和饱和湿度下的培养箱内，继续培养12h和24h。终止培养前1h，每孔加入100μl CCK8溶液，混匀，在细胞培养箱继续孵育1h后，于酶标仪上490nm波长处检测各孔的光密度OD值，按试剂盒说明，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=D（λ）实验组/D（λ）对照组×100%，则对照组存活率为100%。

2.4数据分析采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3结果

3.1不同浓度对细胞存活率的影响石油醚层对人肺癌A459和人肝癌HepG2细胞存活率均没有影响（P>0.05）。乙酸乙酯部位和正丁醇部位对两种细胞株均具有一定的抑制作用。与石油醚组相比，作用12h、50μg/ml的乙酸乙酯部位药物对肿瘤细胞的存活率无显著性差异。随着乙酸乙酯部位浓度升高至100μg/ml时，对A549细胞和HepG2细胞存活率分别降至70.46%和74.28%，200μg/ml时，两种细胞存活率分别为56.74%和61.32%，与石油醚组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果显示，乙酸乙酯部位出现良好的剂量依赖性。正丁醇部位在作用时间12h、浓度为50μg/ml时，A549细胞和HepG2细胞存活率分别为69.17%和78.59%，而200μg/ml正丁醇对两种细胞的存活率影响分别为46.12和52.71%，与石油醚组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果显示正丁醇部位对两种细胞株也存在浓度-效应关系。并且相同药物浓度、相同作用时间时，正丁醇部位对于两种细胞比乙酸乙酯更为敏感。

3.2不同时间对细胞生存率影响相同浓度乙酸乙酯部位（100μg/ml）对A549细胞的存活率在12h和24h分别为70.46%和68.45%；HepG2细胞的存活率分别为74.28%和67.41%；正丁醇部位（100μg/ml）对A549细胞处理12h和24h，细胞存活率分别为64.19%和53.46%，而HepG2的影响分别为62.41%和58.43%，由此可见，随着药物作用时间的延长，药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用也随之升高。

4讨论

目前罹患癌症的病例呈逐年增长的趋势。癌症是机体与外界环境因素长期相互作用的结果，主要诱因有环境污染及诸如吸烟、不健康饮食、体力活动少等不良的生活方式。我国肺癌及肝癌的发病率较高，死亡率在癌症中也最高。随着中医药现代化研究的深入，中药在治疗癌症方面有了很大的进展。荭草为民间及民族常用中药，文献报道其有一定的抗肿瘤作用[3]。本文通过对荭草不同溶剂萃取物对肺癌A549细胞、肝癌HepG2细胞进行体外活性的筛选，为其抗肿瘤活性研究及临床应用提供实验依据及参考。

本实验通过CCK8法，对荭草醇提液的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位对人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞进行体外活性的抑制作用进行研究，结果表明乙酸乙酯、正丁醇2个萃取部位对人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞均有抑制增殖的作用影响，且正丁醇部位对上述两种肿瘤细胞的增殖影响较大（生存率最低为39.18%和46.57%），比乙酸乙酯部位（最低值为49.16%、57.44%）抑制作用更明显。说明荭草抗肿瘤的活性部位集中在大极性部分。并且，给药剂量与给药时间与肿瘤增殖抑制具有直接关系，随着给药剂量和给药时间的增加，肿瘤细胞生存率降低，达到200μg/ml和24h时的影响最大。荭草的主要化学成分为黄酮类化合物，且黄酮类化合物具有一定的抗肿瘤作用，荭草的抗肿瘤活性是否与黄酮类成分的含量有关仍需进一步的实验研究。

参考文献

[1] 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草（第二册）[M].上海：上海科技出版社，1998：681-683.

[2] 陈秋荣.黄酮类化合物药理作用的分析[J].中国实用医药，2012，7（21）：254-255.

[3] 李勇军，何迅，刘志宝，等.荭草化学成分的研究[J].中国中药杂志，2009，34（20）：2613-2614.

[4] 宋青，楼一层.红蓼对肿瘤细胞的作用研究[J].中国药师，2009，12（10）：1340-1342.

[5] 翟延君.水红花子质量标准规范化研究[D].沈阳：辽宁中医学院，2005：14-37.

[6] 佟苗苗，张宇瑶，初正云，等.荭草花提取物体外抗肿瘤活性研究[J].中国民族民间医药，2013，22（24）：7-8.

（收稿日期：2015.01.22）