皮质注射氯化亚铁建立外伤性癫痫动物模型致痫机制的探讨

郭燕春，李沐，谢泽宇，林岚，许梓璧，王英博

皮质注射氯化亚铁建立外伤性癫痫动物模型致痫机制的探讨

郭燕春，李沐，谢泽宇，林岚，许梓璧，王英博

目的：皮质注射氯化亚铁（FeCl2）致外伤性癫痫（PTE）动物模型，探讨FeCl2致痫的可能机制。方法：成年SD大鼠24只随机分为正常组和模型组，各12只。通过注射FeCl2制作PTE模型，观察各组癫痫发作的行为、脑电图及病理表现，RT-PCR法检测海马及额叶c-fos，c-jun及c-myc mRNA转录水平。结果：模型组在行为学及脑电图表现均接近临床癫痫发作；模型组中c-fos、c-jun mRNA转录水平与正常组差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组中c-myc mRNA转录水平显著高于正常组（P＜0.01）。结论：FeCl2皮质注射制作PTE的机制可能与c-myc mRNA转录水平的升高有关。

外伤性癫痫；动物模型；发病机制

外伤性癫痫（post-traumatic epilepsy，PTE）是外伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）引起的一种癫痫形式，在TBI患者中PTE的发病率为1.9%～30%[1]。2006年，我国学者林元相等[2]对铁离子注射模型进行部位及剂量的改良后发现，皮质注射氯化亚铁（FeCl2）建立PTE动物模型比既往模型更接近人类PTE临床与病理改变。但目前注射FeCl2致外伤性癫痫的机制未完全明确。

在原癌基因家族中，有一类能被第二信使所诱导的原癌基因，被称为快反应基因（immediately early genes，IEGs），主要包括fos、jun和myc等家族[3]。IEGs作为中枢神经系统的表达产物，可通过调节转录的作用使与癫痫发生有关的目标基因发生改变，进而造成癫痫病灶的形成[4]。Morgan等[5]及Takemoto等[6]证明各种致痫刺激能使IEGs表达产生明显变化，且这种表达具有刺激特异性、细胞特异性和时程特异性。c-fos、c-jun及c-myc等基因在神经元活化、突触重塑性及神经细胞凋亡中发挥重要作用[7]。本研究拟观察皮质注射FeCl2是否对上述基因的表达产生影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组健康成年雄性SD大鼠24只，体质量180～220 g，由汕头大学医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂逆转录试剂盒购于TaKaRa公司，Trizol购于北京康为世纪公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及动物模型制备采用随机数字表法将大鼠随机分为正常组和模型组，各12只。正常组不予任何处理。模型组参考文献[2]方法制作癫痫模型：10%水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔麻醉大鼠，固定于立体定向仪，暴露颅骨，前囟后2 mm，旁开3 mm，在颅骨钻孔，右额叶运动区皮质注射0.1 mol/L的FeCl210 μL，致痫后立即腹腔内注射3 mg/kg生理盐水。

1.2.2 脑电记录及行为学观察将前端钝圆的纯银丝置于硬脑膜之外，用牙托粉将银丝与颅骨固定，银丝的另一端连接无线蓝牙脑电监测系统。2组动物在制模后以视频脑电图（video-EEG，VEEG）进行检测。根据Racine分级，4级以上发作，EEG在尖、棘波基础上出现阵发性异常放电为模型成功。

1.2.3 组织学观察制模后30 d，各组取6只大鼠，100 g/L水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔麻醉，经左心室-升主动脉插管，室温下灌注生理盐水150 mL，再灌注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS（pH值7.4，4℃）300 mL，完整取脑，固定，石蜡包埋。约位于海马CA3层面及额叶以石蜡切片机连续冠状切片用于H-E染色实验。

1.2.4 c-fos、c-jun及c-myc mRNA水平制模后30 d，各组取6只大鼠，处死后取脑（海马及额叶），Trizol法提取总RNA，用逆转录试剂盒进行cDNA合成，进行PCR反应。c-fos上游引物序列：5’-TCCAAGCGGAGACAGATCAAC-3’，下游引物序列：5’-TCCAGGGAGGTCACAGACAT-3’。c-jun上游引物序列：5’-GCACATCACCACTACACCGA-3’，下游引物序列：5’-GACACTGGGCAGCGTATTCT-3’。c-myc上游引物序列：5’-CAGCTCGCCCAAATCCTGTA-3’，下游引物序列：5’-TGATGGGGATGACCCTGACT-3’。反应条件：预变性94℃1 min，变性94℃20 s，退火62℃30 s，延伸72℃30 s，最后1次延伸72℃5 min，共27个循环。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，图像分析仪计算待测基因光密度比值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠行为学表现

FeCl2注射致痫后1～35 min，大鼠出现阵发性凝视、不动，后开始表现为湿狗样运动，部分大鼠出现一侧前肢震颤；甚至出现全身性强直-阵挛性发作；造模过程无死亡。模型组出现典型急性期、静止期及发作期。正常组无上述表现。

2.2 脑电图变化

正常组大鼠的EEG频率为5～10 Hz，波幅＜200 pV，以低幅p波、Q波为主，散在e波，未见癫痫样放电，见图1A。模型组大鼠注射FeCl2后EEG表现出多种形式的癫痫样放电波形，如单棘波、多棘波、多相棘波等，频率最快可达30 Hz，波幅高达300 pV以上，发作后可出现抑制波，部分存在亚临床放电，见图1B。

2.3 组织学观察

模型组海马及右侧额叶神经元缺失，CA3区最明显，细胞核固缩、浓染，出现嗜酸性神经元，细胞排列紊乱，胶质细胞增生，见图2B、D。正常组细胞排列规整，未见明显的细胞核固缩、浓染等现象，见图2A、C。

2.4 c-fos、c-jun、c-myc mRNA转录水平2组c-fos及c-jun mRNA转录水平

差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组中c-myc mRNA转录水平显著高于正常组（P＜0.01），见图3，表1。

3 讨论

图1 正常组（A）和模型组（B）大鼠EEG

图2 各组大鼠右侧额叶及海马组织学观察（HE染色，×400）

图3 正常组（A）和模型组（B）c-fos、c-jun、c-myc mRNA的PCR电泳图

表1 各组c-fos、c-jun、c-myc mRNA转录水平比较（

表1 各组c-fos、c-jun、c-myc mRNA转录水平比较（

注：与正常组比较，①P＜0.01

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本研究制模大鼠的行为学及EEG表现均接近于临床，且死亡率为0，制模成功。多项研究认为细胞过度凋亡在PTE发病过程中作用明显[8,9]。另一研究发现PTE大鼠损伤部位及附近区域脑组织神经元丢失严重[10]。本研究再次验证了上述结果。

本研究发现模型组中c-myc mRNA转录水平较正常组显著升高（P＜0.01）。笔者推测注射FeCl2的致痫机制可能与c-myc过度表达有关。有研究表明，MYC失调使ARF上调，并通过ARF-MDM2-p53通路诱发凋亡[11,12]。与此同时，MYC过度表达间接地抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达[13]；Bcl-2可调节线粒体外膜渗透率，以阻断细胞色素C、细胞凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）等蛋白的释放，从而抑制染色质浓缩等致细胞凋亡[14]。故笔者推测注射FeCl2的致痫机制可能与ARF-MDM2-p53通路及Bcl-2有关。

本研究发现模型组中c-fos及c-jun mRNA转录水平与正常组差异无统计学意义（P＞0.05）；c-fos与c-jun编码的2种蛋白在核内形成异源二聚体，即活化蛋白转录因子-1（activator protein transcription factor-1，AP-1）。AP-1可直接或间接激活细胞内的限制性核酸内切酶，并影响晚期靶基因的表达，导致细胞核DNA结构改变，造成神经细胞凋亡和坏死[15]。笔者推测皮质注射FeCl2后局部神经细胞过度凋亡与AP-1过度表达无关。

综上所述，FeCl2导致局部神经细胞过度凋亡，进而导致PTE发作；其机制可能与c-myc过度表达有关。本研究的样本数量及观察周期有其局限性，需进一步深入研究。

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（本文编辑：唐颖馨）

《神经损伤与功能重建》杂志简介

本刊是中华人民共和国教育部主管，华中科技大学同济医学院主办的国家级神经科学专业学术性期刊（双月刊），2006年入选为中国学术期刊综合评价数据库统计源期刊，2007年6月被收录为中国科技论文统计源期刊(中国科技核心期刊)。本刊同时被万方数据、中国知网、重庆维普等数据库收录。此外，本刊从2008年起与国际知名杂志《Glia》(IF:5.0)合作，开辟“Glia优秀研究论文”专栏。定价：15元/期，全年定价：90元，邮发代号：38-47

Mechanisms of FeCl2-induced Post Traumatic Epilepsy Model on Rats

GUO Yan-chun,LI Mu,XIEZe-yu,LIN Lan,XU Zi-bi,WANG Ying-bo.Department of Neurosurgery,Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,Guangdong 515041,China

Objective:To establish FeCl2-induced post traumatic epilepsy(PTE)model,and to explore thepossible mechanisms.Methods:Twenty-four healthy adult SD rats were randomly divided into control group(n=12) and model group(n=12).The PTE animal model was established by injecting FeCl2into the cerebral cortex. Changes in behaviors,electroencephalograms(EEG)and histology of the hippocampus and frontal lobes were studied.The expression levels of c-fos,c-jun and c-myc mRNA were tested.Result:The behaviors and EEG of the rats in the model group were similar to the clinical feature of human epileptic seizures.There was no statistical difference in the expression levels of c-fos and c-jun mRNA between the normal control group and model group (P＞0.05).As compared with the control group,the expression level of c-myc mRNA in the model group was increased significantly(P＜0.01).Conclusion:The FeCl2-induced PTE model may be meditaed by the increase of the expression level of c-myc mRNA.

post traumatic epilepsy;animal models;mechanism

R741；R742.1

ADOI10.3870/sjsscj.2015.02.006

汕头大学医学院第二附属医院神经外科
广东汕头515041

广东省科技计划项目（No.2011B0318 00109）

国家级大学生自主创新训练项目

（No.1056013092）

2015-02-02

李沐

877734710@qq. com