GABAA受体γ2亚单位在海人酸颞叶癫痫大鼠海马内的表达

戚月凤，汤继宏，李岩，顾琴

GABAA受体γ2亚单位在海人酸颞叶癫痫大鼠海马内的表达

戚月凤1，汤继宏2，李岩2，顾琴2

目的：探讨癫痫发作后GABAA受体γ2亚单位在海马各区的动态表达以及氯硝西泮干预对其表达的影响。方法：健康成年雄性SD大鼠40只，随机分为对照组5只，致痫组15只，干预组15只，干预对照组5只。大鼠海马CA3区注射海人酸建立颞叶癫痫模型，干预组大鼠在致痫前予以氯硝西泮灌胃。于致痫后6 h、12 h和1 d采用免疫组化法检测各组大鼠海马CA1及CA3区γ-氨基丁酸A受体γ2亚单位（GABAARγ2）的动态表达水平。结果：致痫组在海人酸给药后6 h、12 h及1 d，海马CA3区GABAARγ2蛋白表达均显著低于对照组（P＜0.01）；CA1区GABAARγ2蛋白表达也下降，注射后1 d显著低于对照组（P＜0.01）。干预组在海人酸注射后1 d CA1和CA3区GABAARγ2蛋白表达低于对照组（P＜0.05）；海人酸注射后6 h、12 h及1 d，CA3区GABAARγ2蛋白表达均高于同时间点致痫组（P＜0.05），CA1区于海人酸注射后1 d，GABAARγ2蛋白表达显著高于同时间点致痫组（P＜0.01）。结论：海人酸诱导的颞叶癫痫模型中，海马GABAARγ2蛋白表达减少，氯硝西泮可缓解颞叶癫痫导致的GABAARγ2蛋白表达减少。

颞叶癫痫；GABAA受体；γ2亚单位；海人酸；海马

颞叶癫痫是常见且治疗较棘手的局灶性癫痫，约占难治性部分性癫痫的70%[1]。其病因复杂，临床研究其病因及致痫机制困难，经实验性颞叶癫痫模型加以研究是主要而有效途径。本研究通过大鼠海马CA3区注射海人酸建立模拟人类复杂部分发作的颞叶癫痫动物模型[2,3]，以γ-氨基丁酸A受体γ2亚单位（A-type receptor of γ-aminobutynic acid γ2 subunit，GABAARγ2）为研究对象，观察其在致痫大鼠海马各区不同时间点的动态表达及地西泮干预对其影响，以了解该受体亚单位在癫痫发作中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 实验动物及分组健康成年雄性SD大鼠40只，由苏州大学动物中心提供。大鼠随机分为4组：对照组5只，致痫组15只，干预组15只，干预对照组5只。

1.1.2 实验试剂海人酸购于Sigma公司，兔抗GABAARγ2多克隆抗体购于吉泰生物科技有限公司，免疫组化染色试剂盒和DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 建立颞叶癫痫动物模型致痫组大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后俯卧位固定于立体定向仪，按照大鼠脑立体定向图谱[4]确定海马CA3区给药点的三维坐标，微量注射器注入0.4 μg/μL海人酸（4 μg/kg）。对照组大鼠以相同方法注射等量生理盐水。干预组大鼠在致痫前予以氯硝西泮（6 mg/kg·d）灌胃，2次/日，连续5 d，然后采用与致痫组相同方式致痫。干预对照组给予2 mL生理盐水灌胃，其他与干预组相同。术毕将大鼠放回笼中，观察其行为改变，2次/日。惊厥发作程度按Racine[5]分级标准：0级：无任何发作迹象；Ⅰ级：面肌抽搐包括凝视、节律性咀嚼、眨眼、立须、湿狗样颤动等；Ⅱ级：颈肌抽搐，节律性点头运动为主；Ⅲ级：单侧前肢抽搐；Ⅳ级：双侧前肢阵挛、抽搐伴身体立起；Ⅴ级：双侧后肢强直，身体背曲强直，跌倒伴全身阵挛。Racine分级在3～4级以上鼠为模型成功，纳入研究。

1.2.2 HE染色观察海马病理学改变及免疫组化法测定海马GABAARγ2表达于致痫后6 h、12 h和1 d灌注固定和取脑，各时间点5只。石蜡包埋，于海马部位连续冠状切片，片厚4 μm，切片隔4张取1张，行HE染色，相邻切片行GABAARγ2免疫组织化学染色。以兔抗GABAARγ2免疫组化多克隆抗体为一抗，按试剂盒说明采用SABC法行免疫组化染色，DAB着色，阳性着色为棕黄色，对照实验以PBS代替一抗。用图像采集分析软件（Image-Pro-Plus）计算出GABAARγ2亚单位在相同放大倍数（×400）显微图片中海马各区的阳性染色面积百分比，各区取平均数。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 海马病理改变

致痫组大鼠在海人酸注射后6 h即可见其注射侧海马神经元受到损害，以CA3区最明显，正常细胞明显减少；可见神经元细胞肿胀、排列不整齐、稀疏，细胞间隙增大，细胞体突起明显减少，细胞轮廓不清，胞核异位，核仁模糊；坏死的神经元胞浆浓缩、深染，核碎裂；星形胶质细胞体积增大，胞浆淡染；齿状回颗粒细胞部分受损，其胞核固缩，细胞排列杂乱。海人酸注射对侧的海马结构亦受破坏，但受损程度明显轻于对侧。干预组大鼠海马神经元受损较致痫组较轻。

2.2 各组大鼠海马各区GABAARγ2的表达

各组大鼠海马CA1及CA3区均出现GABAARγ2蛋白免疫阳性细胞，胞体和胞浆呈棕黄色，周围有放射状突起，胞核未着色。致痫组在海人酸给药后6 h、12 h及1 d，海马CA3区GABAARγ2蛋白表达均显著低于对照组（P＜0.01）；CA1区GABAARγ2蛋白表达也下降，注射后1 d显著低于对照组（P＜0.01）。对照组与干预组GABAARγ2蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。干预组在海人酸注射后1 d CA1和CA3区GABAARγ2蛋白表达低于对照组（P＜0.05）；海人酸注射后6 h、12 h及1 d，CA3区GABAARγ2蛋白表达均高同时间点致痫组（P＜0.05），CA1区于海人酸注射后1 d，GABAARγ2蛋白表达显著高于同时间点致痫组（P＜0.01）。见图1、表1。

3 讨论

癫痫发作损伤神经细胞，海马神经元的损伤和脱失在癫痫（尤其是颞叶癫痫）的发生中起着关键性作用，两者互为因果[6]。本研究发现，一侧海马CA3区注射海人酸，双侧海马均可出现神经元变性。目前认为，注射侧神经元损害可能是海人酸的直接兴奋毒性作用，海人酸受体为离子型谷氨酸受体，在海马CA3区特异性高亲和力受体最多，因此该区最容易出现神经元过度兴奋而致神经元死亡。而对侧则可能是由传入兴奋性通路的过度兴奋造成，与癫痫放电的突触传播及脑组织的血流/氧耗比下降所引起的缺血-缺氧有关。本研究还观察到，在海马神经元缺失的区域可见胶质细胞明显增生，形成胶质团块，与人类颞叶癫痫的海马硬化极为相似（数据未提供）。因此，一侧海马注射海人酸所造成的病理损害类似于人类颞叶癫痫，并可能是造成慢性反复性自发发作的主要基础。

图1 各组海马CA3区GABAARγ2蛋白免疫组化检测结果（光学显微镜，×400）

表1 各组大鼠海马CA1和CA3区GABAARγ2蛋白表达比较

表1 各组大鼠海马CA1和CA3区GABAARγ2蛋白表达比较

注：与对照组比较，①P＜0.01，②P＜0.05；与同时间点致痫组比较，③P＜0.01，④P＜0.05

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癫痫的发病机制极其复杂，但最后通路是兴奋性和抑制性不平衡导致大脑神经元异常放电。GABA是中枢神经系统内最重要的抑制性神经递质，在中间神经元内合成和分泌，在慢性癫痫中癫痫发作引发选择性的中间神经元凋亡和坏死，可导致GABA抑制性作用不足，进而导致癫痫反复发作[7]。GABA受体亚型主要有GABAA和GABAB。GABAAR与癫痫关系最密切，其是由镶嵌在神经细胞膜双层脂质中的2α、2β、1γ 5个亚基组成的五边形异质多肽寡聚体大分子[8,9]。在成熟脑中GABAARα1与γ2亚单位的组合广泛表达，数量最多，而且α1和γ2亚单位是苯二氮卓类药物的抗痫作用位点，该2种亚单位的异常可产生快速的苯二氮卓类药物抵抗，有重要的临床意义。

关于亚单位α1与癫痫关系的研究国内外亦已有多篇报道[10-12]，关于亚单位γ2的研究较少。本文通过海人酸大鼠模型研究癫痫发作后GABAARγ2亚单位的表达，发现在CA1和CA3的锥体细胞层内，γ2亚单位免疫反应性在急性期（6～24 h）均下降，这与CA1区和CA3区锥体细胞层的损伤相一致，说明CA1区和CA3区锥体细胞层的损伤导致了γ2亚单位在该区域内蛋白水平的下降，提示在该区域内GABA能传递的缺损。本研究结果与Tsunashima和Schwarzer等[14,15]等通过原位杂交研究的海人酸诱导大鼠癫痫发作后GABAARγ2亚单位mRNA在急性期海马中的表达基本一致。不仅GABAARγ2亚单位表达异常与癫痫发作有关，GABAAR亚单位γ2多种突变（K289M、R43Q、Q351、R139、W390X等）亦与癫痫发作密切相关[16-19]。GABAARγ2表达在海马各区的减少可能是颞叶癫痫发作后海马神经元缺失所致，但GABAARγ2表达减少可能导致癫痫的进一步发展，随时间推移海马区残存的锥体细胞GABAARγ2表达有增加趋势（数据未提供），此可能为颞叶癫痫的内源性自我保护机制，通过表达增多，加强抑制作用，更好地防止癫痫反复发作。

氯硝西泮是目前临床上用于治疗急性癫痫发作的最常用药物，为苯二氮卓受体完全激动剂。氯硝西泮对癫痫发作后神经元的保护作用与神经元GABA受体上苯二氮卓位点的激活有关。现认为苯二氮卓类的作用位点在α和γ亚单位上，γ2亚单位的存在有利于苯二氮卓的正性调节作用[20-22]。地西泮通过作用于α1和γ2亚单位增强GABA与其受体的作用,有利于神经元产生抑制性突触后电位，使癫痫发作后缺血神经元的兴奋性降低和损伤程度减轻，该2种亚单位的异常可产生快速的苯二氮卓类药物抵抗。本研究结果表明，氯硝西泮可增强癫痫急性期海马GABAARγ2表达水平，能减轻海人酸所致的早期神经元损伤，对神经元有保护性作用。

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（本文编辑：唐颖馨）

Expression of GABAA Receptor γ2 Subunit in Hippocampus of Rats with KA-induced TemporalLobe Epilepsy

QI Yue-feng,TANG Ji-hong,LI Yan,GU Qin.Department of pediatrics,Shandong Jining No.1 People’s Hospital,Shandong 272002,China

Objective:To study the expression of GABAA receptor γ2 subunit(GABAARγ2)protein in hippocampus of rats with KA-induced temporal lobe epilepsy.To investigate the effect of clonazepam(CZP)administration on expression of GABAARγ2.Methods:Forty male SD rats were randomly divided into control group(n=5), epilepsy group(n=15),intervention group(n=15),and intervention control group(n=5).Temporal lobe epilepsy model was established by injecting kainic acid into CA3 region of the hippocampus in rats in both the epilepsy and intervention groups.Rats in the intervention group were treated with CZP.The expression of GABAARγ2 protein was investigated by immunohistochemistry at 6 h,12 h and 1 d after operation respectively.Results:The expression of GABAARγ2 protein in CA3 of the rats in the epilepsy group was significantly lower than that in the control group(P＜0.01)at 6 h,12 h and 1 d after operation and the expression of GABAARγ2 protein in CA1 region was significantly lower than that in the control group(P＜0.01)only at 1 d after operation.The expression of GABAARγ2 protein in both CA3 and CA1 regions in the intervention group were lower than that in the control group(P＜0.05).The expression of GABAARγ2 protein in CA3 region was significantly higher than that in the epilepsy group at 6 h,12 h and 1 d after operation(P＜0.05)and the expression of GABAARγ2 protein in CA1 was significantly higher than that in the epilepsy group(P＜0.01)only at 1 d after operation.Conclusion:The expression of GABAARγ2 protein was decreased in hippocampus of temporal lobe epilepsy model rats,and CZP could relieve the decrease of GABAARγ2 protein.

temporal lobe epilepsy;GABAA receptor;γ2 subunit;kainic acid;hippocampus

R741；R742.1

ADOI10.3870/sjsscj.2015.02.005

1.山东济宁市第一人民医院儿科
山东济宁272002 2.苏州大学附属儿童医院神经科
江苏苏州215003

江苏省自然科学基金

（No.BK2011309）

2014-12-10

汤继宏

tjhzsh@126.com