36例遗传性耳聋的产前诊断分析

李玲 麦明琴 曾玉坤 饶腾子 丁红珂 刘玲

（广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东广州 510010）

36例遗传性耳聋的产前诊断分析

李玲 麦明琴 曾玉坤 饶腾子 丁红珂 刘玲

（广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东广州 510010）

目的通过超声引导下介入性穿刺术获取胎儿附属物标本进行遗传性耳聋基因产前诊断，降低遗传性耳聋患儿的出生率。方法孕11～14周孕妇采用超声引导下绒毛活检术抽取胎盘绒毛；孕16周后孕妇在超声引导下抽取羊水；孕25周以上因有其他项目需同时产前诊断的，则在超声引导下抽取脐血。应用短串重复序列连锁分析（STR）进行母血污染鉴别，遗传性耳聋基因芯片检测技术对GJB2、GJB3、SLC26A4和mtDNA12SrRNA 4个耳聋基因进行测序。结果36例产前介入性穿刺术均一次成功。36例标本经STR鉴定均排除母血污染。7例未检测到明确耳聋基因突变；16例为耳聋基因杂合突变，3例为耳聋基因杂合突变伴多态性位点突变，已出生的，生后随访新生儿听力筛查结果均正常；10例为耳聋基因双重杂合突变，经遗传咨询后，孕妇及家人选择终止妊娠。结论超声引导下行介入性穿刺术是进行遗传性耳聋基因产前诊断获取胎儿附属物标本的有效途径。联合耳聋基因芯片检测技术及STR检测，可排除母血污染，准确诊断胎儿遗传性耳聋基因型，有效降低遗传性耳聋患儿的出生率。

遗传性耳聋；介入性穿刺术；产前诊断

耳聋是人类最常见的致残原因之一，严重影响着人类的生活质量并带来沉重的社会及家庭经济负担。据估算，我国每年约有2000万的新生儿出生，而耳聋的发生率可达1‰，其中至少约60%～70%与遗传因素有关［1，2］，即遗传性耳聋。它包括综合征性耳聋及非综合征性耳聋，非综合征性耳聋占遗传性耳聋的70%，其中的77%为常染色体隐性遗传。人类遗传学研究的开展和基因芯片等遗传学应用技术的进步，极大地推进了临床上遗传性耳聋的基因诊断和遗传咨询。研究表明，在中国人群中，遗传性耳聋的主要致病基因包括GJB2、GJB3、SLC26A4和mt DNA12Sr RNA，其遗传方式为常染色体隐性遗传［3，4］，通过热点突变基因的筛查可以实现遗传性耳聋的早防早治。对有明确遗传学病因和遗传风险的耳聋家庭，选择产前诊断技术可有效避免遗传性耳聋儿的出生，切实降低出生缺陷。本院医学遗传中心在2011年3月至2014年2月期间，共为36个胎儿进行了适宜的产前诊断，现分析及总结如下。

1 资料与方法

1．1 研究对象 2011年3月至2014年2月32例在广东省妇幼保健院医学遗传中心行胎儿耳聋基因产前诊断的孕妇。22例孕妇曾生育过遗传性耳聋患儿，先证者均已行耳聋基因确诊，同时检测出夫妇双方均为耳聋基因携带者；14例孕妇为孕检或婚检时耳聋基因筛查为耳聋基因携带者，随后配偶已诊断为耳聋基因携带者。

1．2 方法与仪器

1．2．1 超声引导下介入性穿刺术 36例孕妇均行超声检查，排除无脑儿、严重胸腹壁裂、开放性脊柱裂、单心室等致死性畸形及明显的胎儿结构异常，并完善常规穿刺前检查。手术时，在超声定位下，选择安全及适宜位置进针。6例孕11～14周胎儿，采用18G一次性PTCD针绒毛活检术抽取胎盘绒毛10 mg；25例孕16～24＋6周胎儿，采用20G一次性PTCD针抽取羊水10 ml；5例孕25周以上胎儿，夫妇双方均为耳聋基因携带者，同时因超声提示胎儿异常需行产前诊断，采用22G一次性PTCD针抽取脐血3 ml。术后观察胎心，孕妇术后在休息室休息半小时，无异常后离院。术后定期复诊及随访。所有行产前诊断的孕妇均签署介入性产前诊断及耳聋基因诊断知情同意书。

1．2．2 STR鉴别母血污染 采用QT PCR技术，ABI公司3500XLsystem，在测序仪上对母亲及胎儿的26个STR位点（AMEI、DXS981、DYS448、D21S1412、D13S256、DXYS267等）进行测定，然后利用软件自动分析等位基因的基因型。

1．2．3 基因检测 采用厦门致善试剂盒提取绒毛、羊水、脐血DNA，测量DNA浓度计纯度，DNA浓度为100～200 ng／μl，纯度OD260／280在1．7～2．0之间。将DNA加入反应体系中进行PCR扩增，扩增体系见表1，反应条件见表2。按照8μl杂交缓冲液、4μl A体系PCR产物、4μl B体系PCR产物的比例配制杂交溶液。按照杂交盒、垫片、芯片、盖片的顺序装配好杂交反应盒。运行遗传性耳聋基因检测芯片杂交程序，杂交条件为50℃杂交1．5小时，速度为15 rpm。反应结束后进行芯片洗涤。使用奥博基因芯片扫描仪进行芯片扫描，记录判读结果和芯片信息。

表1 基因扩增体体系表

表2 遗传性耳聋基因检测PCR扩增条件

2 结 果

2．1 36例行介入性产前诊断孕妇均无感染、流产、早产、胎儿宫内窘迫等并发症。经STR鉴别，36例全部排除母血污染。

2．2 36例遗传性耳聋基因产前诊断结果中，7例未检测到明确突变，随访新生儿听力筛查结果未见异常。7例GJB2基因109杂合突变；7例GJB2基因235．del．c杂合突变；2例SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G杂合突变；1例SLC26A4基因IVS7-2A＞G，GJB2基因c．608．T＞C杂合；1例GJB2基因235．del．c杂合突变，GJB2 c．79G＞A，c．341A＞G；1例GJB2基因235．del．c杂合突变，79G＞A杂合（多态），22例随访新生儿听力筛查结果均未见异常，4例未出生。10例双重杂合突变：包括6例GJB2基因109 G＞A／235 del C双重杂合突变，1例GJB2基因109 G＞A／c．250 G＞A双重杂合突变，1例GJB2基因235 del C／c．176 del 16bp双重杂合突变；1例SLC26A4基因c．1343 C＞T／c．2086 C＞T双重杂合突变，均与先证者基因型一致；1例SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G／754 T＞C双重杂合突变。10例随访结果孕妇均已选择终止妊娠。

3 讨 论

耳聋是影响我国出生人口素质的重要问题之一，目前临床上对遗传性耳聋缺乏有效的治疗手段。患儿往往需要使用辅助听力器械协助，部分患儿因未能及时诊治而影响生活与学习，并且可能对家庭造成较大经济负担。因此，遗传性耳聋的产前诊断在耳聋出生缺陷的防治工作中具有重要意义。遗传性耳聋产前诊断是应用耳聋基因测序技术了解胎儿携带耳聋基因的情况，从而做出是否为遗传性耳聋的诊断。目前研究发现我国人群遗传性耳聋的最常见的致病基因为GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12Sr RNA，基因突变是中国人群中常见的致病原因，通过对热点突变的筛查可以实现遗传性耳聋的产前预防。我们通过超声引导下在胎盘上抽取绒毛组织、羊膜腔穿刺抽取羊水、脐带穿刺抽取脐血等微创性取样方法，提取胎儿DNA进行耳聋基因测序，获取胎儿耳聋基因的遗传信息。为了排除行产前诊断过程中母体DNA的影响，结合运用STR位点分析方法以排除母血污染。

3．1 GJB2与遗传性耳聋 GJB2是最常见的耳聋基因。GJB2编码连接蛋白（connexin26），负责细胞间信号介导和离子传递，突变的GJB2可能导致产生不正常的连接蛋白，进而干扰细胞间隙连接的功能，引起内耳钾离子回收障碍而致聋。研究表明到目前为止已发现GJB2基因110余种突变方式，GJB2突变导致的遗传性耳聋几乎遍布欧洲、美洲、亚洲等地，在不同人种间存在不同的GJB2基因突变及发生频率［5］。在我们的研究中，未检测到GJB2基因的纯合性突变。而发现7例GJB2基因109 G＞A杂合突变，7例GJB2基因235．del．c杂合突变，1例GJB2基因235．del．c杂合突变合并GJB2 c．79G＞A、c．341A＞G突变，这7例孕妇均顺利分娩，回访结果显示，婴儿听力测试正常。发现的6例 GJB2基因235 del C杂合突变伴109 G＞A杂合突变，1例GJB2基因109 G＞A杂合突变伴c．250 G＞A杂合突变，1例GJB2基因235 del C杂合突变伴c．176 del 16 bp杂合突变，因胎儿患耳聋风险增加，回访显示孕妇均选择终止妊娠。有研究显示不仅致病突变的纯合性突变可以致聋，而且不同的两个致病突变形成复合杂合突变时也可致聋，临床表现为中重度耳聋，双耳多呈对称性，前庭功能基本正常，但在少数病例也存在临床表型的异质性。Wilcox SA等［6］研究发现109G＞A纯合和复合杂合突变和耳聋有关。陈帼玲等［7］在一项包括233名耳聋患者及83名患者直系亲属、100名听力正常志愿者的研究发现，耳聋患者组中共发现4例109 G＞A杂合突变伴c．235 del C杂合突变，而家属组和对照组中未发现此类型突变。250 G＞A突变是近年发现的一个致病位点，目前研究甚少，在国内尚未见报道。Matos等［8］在一位葡萄牙女性耳聋患者的家系研究发现，-3438C-T和250G-A突变为复合杂合子后会引起亮氨酸变成蛋氨酸，从而导致耳聋的出现。这些研究结果提示了会导致听力障碍的复合突变，其突变位点之间可能存在内部修饰效应，也可能是由不同基因之间的相互影响造成。

3．2 SLC26A4（又称PDS基因）与遗传性耳聋SLC26A4基因编码Pendrin蛋白，研究表明Pendrin功能与离子和蔗糖转运有关［9，10］。有分析表明95%～97%的中国大前庭水管患者中至少可以发现一个SLC26A4基因突变，并且大多数患者可以发现纯合或复合突变，显示大前庭水管综合征的发病原因是SLC26A4基因突变［11］。在我们的研究中，发现2例SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G杂合突变，1例SLC26A4基因IVS7-2A＞G／GJB2基因c．608．T＞C杂合，这3例孕妇均顺利分娩，回访结果显示婴儿听力测试正常。1例SLC26A4基因c．1343 C＞T杂合／c．2086 C＞T杂合，与先证者基因型一致，1例SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G杂合突变／754 T＞C杂合突变，因胎儿患耳聋风险增加，回访显示孕妇均选择终止妊娠。754T＞C位点目前在国内外报道较少，冯永等［12］在一项家系研究中发现患耳聋的先证者为1229C＞T、754T＞C的复合杂合突变，1229C＞T来自其表型正常的父亲，754T＞C来自其表型正常的母亲，与国外报道一致［13，14］。c．2086 C＞T（又称Q696X）是第18号外显子2086位点的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，导致合成蛋白质时696位上的谷氨酸改变为终止密码，从而使蛋白的翻译提前终止［15］。胡鹏等［16］在一项研究中发现该突变的先证者为2086 C＞T和IVS7-2A＞G复合杂合突变，表现为前庭水管扩大伴极重度聋，其父母基因型分别为2086 C＞T和IVS7-2A＞G的单杂合子，听力正常。进一步对100例正常人DNA样本18号外显子进行PCR扩增并测序．未检测出相同突变，故认为c．2086 C＞T是一个新的致聋突变。沈姗姗等［17］对29个耳聋家系的42例耳聋患者及父母进行SLC26A4基因测序，结果显示IVS7-2A＞G纯合性突变患者为极重度感音神经性耳聋，当中有两家系患者发生IVS7-2A＞G杂合性突变，其中一家系患者伴随T410M杂合性突变表现为极重度感音神经性耳聋，另一家系未伴随其他突变，则听力正常。袁永一等［18］在一项人群研究中对SLC26A4基因IVS7-2 A＞G突变相关的全序列分析，这项研究包括1552例聋哑学生和150例听力正常的对照组群，研究中显示1552例耳聋患者中IVS7-2A＞G纯合突变及包含一个IVS7-2A＞G突变的复合杂合突变携带者共161例，占10．37%，正常对照人群IVS7-2 A＞G突变检出率为2%，均为单杂合突变，且均未找到另一个突变位点。事实上，携带SLC26A4单等位基因突变的耳聋患者中有一定比例也表现为不同程度听力障碍［19］，其原因在于另外的突变可能位于非外显子区域，通过现有方法尚不能检测出来。

在遗传咨询及产前诊断的过程中，我们发现充分地告知与知情选择尤为重要。大力进行遗传性耳聋相关知识的宣教是开展耳聋基因筛查的前提，在广大孕龄妇女及产检孕妇当中进行筛查是避免漏诊的关键，对有指征的胎儿适时行产前诊断是降低患儿出生的重点。

遗传性耳聋的产前诊断目前还有许多需改进的方面。首先，由于人类基因组的复杂性及耳聋基因的高度遗传异质性、检测费用昂贵等原因，临床上仅对常见致病基因进行检测，其结论存在一定的局限性，对准确诊断及预防带来了一定的困难；其次，部分突变位点在不同人群研究中得出的结论并不一致，为产前诊断的指导带来一定困惑，尤其是对相互影响的复合突变位点的风险预测，更需要进一步深入的关联研究及生物功能学研究，以进一步阐明其具体致病机制。随着遗传学和无创性产前诊断技术的进步，我们相信遗传性耳聋的产前诊断在降低我国出生缺陷率的工作中将发挥着重要的作用。

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ObjectivePrenatal diagnosis tests were performed under the guidance of ultrasound by chorionic villus sampling，amniocentesis and cordocentesis，all the fetal samplings were sent to detect the hereditary deafness genes in order to reduce the deafness birth defects．MethodChorionic villus sampling in gestation of 11～14 weeks，amniotic fluid by amniocentesis after 16 weeks in gestation，umbilical cord blood sampling after 25 weeks together with other prenatal diagnosis index．Sequencing the four hereditary deafness-related genes GJB2，GJB3，SLC26A4 and mtDNA12Sr RNA，all the samples were excluded the maternal blood contamination by short tandem repeat test（STR）．ResultsIn 36 cases，no definite deafness-related gene mutation in 7 cases，16 cases were found heterozygous，heterozygous with polymorphism were found in 3 cases，and double heterozygous in 10 cases．ConclusionsPrenatal diagnosis procedure under ultrasonic guidance is a safe and effective way in hereditary deafness detection．Combining with the technique of deafness-related gene sequencing and STR，fetus with double heterozygous were diagnosed，then genetic consulting were offered to the parents to considering the baby’s outcome．In that way，the birth rate of hereditary deafness can be reduced．

hereditary deafness；interventional procedure；prenatal diagnosis

R714．53

A

2014-10-19）编辑：宋文颖

10．13470／j．cnki．cjpd．2015．01．011