NMR测定丹酚酸B标准品中有机溶剂残留*

许 磊 ，王 萌 ，王跃飞 ，姜苗苗

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津 300193；2.天津国际生物医药联合研究院，中药新药研发中心，天津 300457）

NMR测定丹酚酸B标准品中有机溶剂残留*

许 磊1，2，王 萌1，王跃飞1，姜苗苗1

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津 300193；2.天津国际生物医药联合研究院，中药新药研发中心，天津 300457）

[目的]用定量核磁共振（QNMR）技术建立中药来源的标准品化合物丹酚酸B中残留甲醇、乙醇和乙酸含量的快速分析方法。[方法]采用BRUKERAVANCEⅢ600型超导核磁共振波谱仪采集谱图，观频率600.23MHz，测定温度298 K。谱宽12 019.2 Hz，采样数据点65 536，扫描次数16次，延迟时间15 s。[结果]所有标准曲线在1.22～2 430mg/L范围内线性良好（r2＞0.999 5)，平均回收率（n＝6）在105%～109%之间。[结论]本方法快速、准确，可应用于样品有机溶剂残留的检测。

液体核磁共振；有机溶剂残留；丹酚酸B；定量分析

中药标准品化合物，是指中药中特征的化学成分或有效的化学物质，在中药产品的质量控制规范和方法中，作为定量控制的标准参照化合物[1]。中药标准品化合物纯度是中药产品的质量控制的关键。在中药标准品的生产制备过程中，常使用大量的有机溶剂进行提取、分离和纯化，导致标准品中不可避免存在有机溶剂残留。因此，有机溶剂残留分析是中药的标准品生产制备的重要环节。目前，有机溶剂残留量检测普遍采用气相色谱法[2-5]。但其操作复杂、耗时，未知样品难以判断其残留有机溶剂种类，对于甲酸、乙酸等不易挥发溶剂响应较差，而且仪器精密度受温度、压力、流动相等因素影响大。

近年来，仪器装置长足发展，核磁共振已经成为强有力的分析工具，在药物分析领域受到广泛关注[6-8]。核磁共振波谱用于定量分析不需要为每一种被测物选择相应的标准品。中药标准品分离困难，价格昂贵，不易获得，而核磁共振波谱不破坏样品，样品可以反复利用。可以同时对有机溶剂定性定量分析，利用核磁共振波谱分析具有优势。

丹参为传统中药，具有舒张血管、保护心肌、抗氧化、抗凝和保护内皮细胞的多种功效[9-10]，丹酚酸B是丹参的主要水溶性成分，具有多方面的药理活性[11-14]，常作为评价丹参质量的指标性成分。在其分离纯化过程中常使用甲醇、乙醇、乙酸等有机溶剂，该实验以丹酚酸B为研究对象，运用定量核磁共振技术（QNMR）建立丹酚酸B中甲醇、乙醇、乙酸残留的检识方法，具有操作简便、分析时间短、不破坏样品、无偏向性等优点，满足药物有机溶剂残留的检测，可为建立其他中药标准品中机溶剂残留量的检测提供科学依据。

1 仪器及试剂

BRUKERAVANCEⅢ600型超导核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克公司），质子激发频率600.23MHz，配置BBFO正相观察宽带探头和BVT3200数字控温仪。5mm标准核磁样品管（美国NORELL公司）。D2O（氘代度 ＞ 99.8%，美国 NORELL 公司）；3－（三甲基甲硅烷）丙酸－d4钠盐（TSP，氘代度 ＞98%，美国 Sigma－Aldrich公司）；甲醇（≥99.5%）、乙醇（≥99.7%）、冰乙酸（≥99.5%）（均购自天津市大茂化学试剂厂）；丹酚酸B标准品（中新药业）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 分别称取甲醇、乙醇和乙酸适量，精密称定，置容量瓶中，加D2O（含内标TSP 0.2 g/L）溶液稀释至刻度，得到甲醇浓度为0.84 g/L，乙醇浓度为0.078 g/L，乙酸浓度为2.43 g/L。

2.1.2 供试品溶液 精密称取供试品10mg，加入0.5mLD2O（含内标TSP 20 g/L），转移至5mm核磁管中，直接用于1H-NMR测试。

2.2 分析方法 采用30°脉冲序列zg30采集样品溶液的1H-NMR图谱。测定温度298 K，观测频率600.23MHz，谱宽 12 019.2Hz，90°脉冲宽度 13 μs，采样数据点65 536，扫描次数16次，延迟时间15 s，接受增益128。用TSP信号定标。

2.3 残留溶剂分析 核磁共振定性鉴定和定量分析可同步完成，定性鉴定有机溶剂无须标准样品，利用谱图化学位移、耦合常数、质子数以及NMR数据[15]，鉴定了样品中甲醇、乙醇和乙酸信号峰，见图1。

QNMR用于定量分析的基础是各化学环境中的质子吸收峰的面积只与所包含的质子数有关，不需引进任何校正因子就可直接根据各共振峰的积分值推算所代表的自旋核的数量[16]。定量的样品峰应选择无其他共振峰干扰。故选择δ3.34处单峰为甲醇定量峰，δ1.19处峰为乙醇定量峰，δ1.94处峰为乙酸定量峰，见图1。

图1丹酚酸B的一维1H-NMR谱图Fig.1 Representative1D 1H-NMR spectraofSalvianolicacid B

2.4 线性关系和范围 精密移取对照品贮备液，加D2O溶液配制为7个标准浓度备用。分别精密量取0.5mL于5mm核磁管中，记录NMR氢谱图。以标准浓度X（g/L）对定量峰与内标物峰积分面积之比Y进行线性回归，得到3种被测物质的标准曲线和相关系数分别是甲醇：Y=8.934X+0.812 6 （r2＝0.999 6）；乙醇：Y＝5.709 4X＋0.041 5（r2＝0.999 8）；乙酸：Y＝5.023 9X＋0.005 8（r2＝1）。

结果表明，甲醇进样量在13～840mg/L，乙醇进样量在1.22～78.3mg/L，乙酸进样量在38～2 430mg/L内线性关系良好。

2.5 精密度实验 取对照品溶液0.5mL，连续测试6次，以甲醇、乙醇和乙酸定量峰峰面积计算，RSD（n＝6）分别为 1.02%、0.64%和 0.38%，精密度良好。

2.6 重复性实验 取丹酚酸B共6份，精密称定，在上述条件下进行测定，以甲醇、乙醇和乙酸定量峰峰面积计算，RSD（n＝6）分别为1.52%、1.34%和0.88%，重复性良好。

2.7 稳定性实验 取供试品溶液0.5mL，分别于0，2，4，6，8，12，24 h 测定，甲醇、乙醇和乙酸定量峰峰面积的 RSD（n＝6）分别为 1.21%、1.15%和 0.78%，供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 样品测定和标准加入回收率 取供试品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下分析条件，计算各样品有机溶剂的残留量。计算含量结果见表1。样品的典型1H-NMR图谱见图1。

向供试品加入已知浓度的3种残留有机溶剂的标准液，在最佳条件下测得3种残留有机溶剂的加标回收率（n＝6）分别为 108.2%（甲醇）、107.3%（乙醇）、105.6%（乙酸）。结果表明，本方法适用于丹酚酸B标准物质有机溶剂残留测定。

表1样品分析结果Tab.1 Determ ination resultsof sam ples %

3 讨论

为了获得准确的定量结果，实验中考察了3种不同脉冲序列（zg30，zg，zgcppr）对定量结果影响，其他条件与上述相同。分别用3种脉冲序列测定已知浓度的有机溶剂标准物的含量，结果以zg30和zg脉冲序列测试1H-NMR图谱峰行较好，定量准确，而zgcppr压制水峰序列对测定影响较大，这可能是由于该序列容易引起信号峰畸变对其他信号峰也有较大影响。zg为90°脉冲，小角度脉冲zg30可在较短时间内获得充分弛豫[17]，节省检测时间，因此优选zg30为实验测试序列。

核磁共振定量，通过比较被测样品定量峰与内标物质响应峰峰面积，即可以对被测物进行定量。本实验以3-（三甲基甲硅烷）丙酸-d4钠盐（TSP）为内标物，在D2O中有良好的溶解度，与D2O和待测物互相不反应。TSP的响应峰值在δ0，与被测物具有良好分离度，因此被选择为内标物。

有机溶剂残留检测属于标准品化合物的纯度测定范围，现行中药准品化合物的纯度鉴别主要以高效液相色谱（HPLC）法为主，而HPLC法难以鉴别有机溶剂残留问题，影响中药质量控制。有机溶剂残留测定多采用气相色谱法，对于乙酸等不易挥发溶剂使用气相色谱法，基本没有顶空进样方式的响应信号[18]，直接进样则容易导致样品中非挥发性物质对色谱柱的污染与损害[19]，影响有机溶剂定性。采用QNMR方法测定样品溶剂残留，在同一张图谱上，可对中药主要物质与其残留溶剂进行定性定量分析，具有快速、简便、准确、专属性高的特点，能满足有机溶剂残留的分析要求。

[1]邱明华.中药标准品化合物的纯度和标准化[J].世界科学技术-中医药现代化,2005,S1:91-97,112.

[2]张在娟,逯 荻,崔丽霞,等.顶空进样气相色谱法测定脑脉通软胶囊中有机溶剂残留量[J].天津中医药,2011,28(6):506-509.

[3]樊春艳,张 沂,刘秀芳,等.GC法测定盐酸法舒地尔中有机溶剂残留量[J].解放军药学学报,2014,30(2):165-166,169.

[4]Pavlovi AD,Ignjatovi LM,Popov SZ,et al.Application of gas chromatography analysis to quality control of residual organic solvents in clopidogrel bisulphate[J].JSerb Chem Soc,2014,79(10):13-13.

[5]Saraji M,Khayamian T,Siahpoosh ZH,et al.Determination of volatile residual solvents in pharmaceutical products by static and dynamic headspace liquid-phasemicroextraction combined with gas chromatography-flame ionization detection[J].AnalMethods,2012,4(6):1552-1559.

[6]Malet-Martino M,Holzgrabe U.NMR techniques in biomedicaland pharmaceutical analysis[J].J.Pharm Biomed Anal,2011,55(1):1-15.

[7]刘 阳,周 颖,张才煜,等.核磁共振定量法测定脒基吡唑含量[J].药物分析杂志,2014,34(6):1087-1090.

[8]刘英华,王 婧,刘振军.核磁共振法快速检测肝素钠粗品[J].分析科学学报,2013,29(4):590-592.

[9]高秀梅,张伯礼,宫 涛,等.丹参及提取物对心血管系统药理作用研究进展[J].天津中医药,2002,19(1):74-76.

[10]范英昌,金树梅,赵桂峰.丹参酮ⅡA对EVC304细胞血管舒缩因子的影响[J].天津中医药大学学报,2006,25(4):215-218.

[11]吕炳强,范英昌,孙连胜.丹酚酸B、丹参酮IIA对动脉粥样硬化家兔血清一氧化氮及甘油三酯的影响[J].天津中医药大学学报,2006,25(1):32-34.

[12]范英昌,华声瑜,郭茂娟,等.丹酚酸B干预骨髓间充质干细胞移植对AMI大鼠心梗区血管新生的影响[J].天津中医药大学学报,2007,26(3):133-136.

[13]华声瑜,赵桂峰,李庆雯,等.丹酚酸B预处理EPCs对AMI大鼠移植骨髓间充质干细胞后心肌微环境的影响[J].天津中医药,2012,29(2):117-120.

[14]华声瑜,范英昌,马轶文,等.丹酚酸B对大鼠骨髓间充质干细胞分化过程中Desmin、α-actinmRNA表达的影响[J].天津中医药,2009,26(2):145-148.

[15]Fulmer GR,Miller AJ,Sherden NH,et al.NMR chemical shifts of trace impurities:common laboratory solvents,organics,and gases in deuterated solvents relevant to the organometallic chemist[J].Organometallics,2010,29(9),2176-2179.

[16]Holzgrabe U,Deubner R,Schollmayer C,et al.Quantitative NMR spectroscopy-applications in drug analysis[J].Journal of pharmaceutical and biomedicalanalysis,2005,38(5):806-812.

[17]Malz F,Jancke H.Validation of quantitative NMR[J].JPharm Biomed Anal,2005,38(5):813-823.

[18]陆 烨,夏宇沁,昌 军,等.毛细管气相色谱法测定13种有机溶剂残留[J].复旦学报(医学版),2013,40(2):222-226.

[19]Smith ID,Waters DG.Determination of residual solvent levels in bulk pharmaceuticals by capillary gas chromatography[J].Analyst,1991,116(12):1327-1331.

Determ ination of the residualorganic solvents in Salvianolic acid B by NMR

XU Lei1,2，WANGMeng1，WANGYue-fei1，JIANGMiao-miao1
（1.Tianjin State Key Laboratory ofModern ChineseMedicine,Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Tianjin 300193,China；2.Research and DevelopmentCenterof TraditionalChineseMedicine,Tianjin International JointAcademyofBiotechnology and Medicine,Tianjin 300457,China）

[Objective]To establish an QNMRmethod for the determination ofmethanol,ethanoland acetic acid in Salvianolic acid B.[Methods]The1H-NMR spectrawasperformed on a Bruker AVⅢ600MHz NMR spectrometerwith a proton frequency of600.23MHz and a temperatureof298K.[Results]Each experimentconsisted of16 scanswith a spectralwidth of12 019.2Hzand a recycle delay of 15 sper scan.All the calibration curvesshowed good linearity(r2>0.999 5)in the rangeof1.22～2 430mg/L.The average recoverieswere 105%～109%（n=6）.[Conclusion]Themethod is rapid and accurate,which is helpful for the determination of the residua1 organic solvents in Salvianolic acid B.

liquid NMR;residua1 organic solvent;Salvianolic acid B;quantitative analysis

R285.5

A

1672-1519（2015）08-0501-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.08.15

国家自然科学基金项目（81303181）。

许 磊（1989－），男，硕士研究生，主要从事中药化学物质基础研究。

姜苗苗，E-mail：miaomiaojiang@126.com。

2015-01-05）

p