双氟沙星对异育银鲫的急性毒性和组织损伤研究

阮记明，隗黎丽，黄建珍，章海鑫，王自蕊

(1.江西农业大学 动物科学技术学院，江西 南昌 330045;2.江西省水产科学研究所，江西 南昌 330039)

氟喹诺酮类(Fluorine quinolones，FQNS)是一类具有6-氟-7-哌嗪-4-诺酮环结构(母核结构)的抗菌药物，具有杀菌力强、抗菌谱广、口服吸收快、生物利用率高、半衰期长等特点，可用于治疗各个系统的感染性疾病［1］。近年来，随着其广泛被使用，其毒副作用也逐渐显现。FQNS常见的毒副作用主要包括中枢神经系统毒性、肝脏毒性、肾脏毒性、软骨毒性、及生殖毒性等［2-4］，经统计分析临床上出现最多的是神经毒性［5］。FQNS引起的神经毒性主要表现为惊厥、昏迷、癫痫等［6-8］。邓艳萍［9］在小鼠脑内注射环丙沙星、依诺沙星、司巴沙星与氧氟沙星等5种氟喹诺酮类抗菌药物时发现，上述5种药物能引起小鼠发生惊厥作用。肝肾毒性方面，长期高剂量使用FQs可产生明显肝毒性，肝肿胀等，甚至肝细胞坏死;肾脏损害表现为尿素氮和血清肌酐值升高;大剂量可形成蛋白尿、结晶尿、血尿等，严重时可出现水肿、间质性肾炎，甚至继发肾功能衰竭。Burkhardt等［10］研究了二氟沙星大剂量(300 mg/kg)用药后，透视观察可见其关节腔内积有泡状囊形物，关节吻合处错位，间距增大，且随着用药时间的增加，关节的损伤程度也在加剧，以肱骨和股骨顶端损伤最为明显。生殖毒性方面，黄文颐等［11］研究发现，盐酸二氟沙星能显著影响胚胎的生长发育，且其严重程度存在剂量效应关系。

双氟沙星(Difloxacin，DIF)，也称二氟沙星，属于第三代FQNS抗菌药物之一。其化学名称为6-氟-1-对氟苯基-1，4-二氢-7-(4-甲基-1-哌嗪基)-4-氧代-3-喹啉羧酸，是由美国Abbott公司于1984年首次合成的。DIF对大多数革兰氏阴性菌和阳性菌、支原体等具有良好的抗菌活性［12］。因此，DIF成为我国水产养殖业上最为常用的抗菌药物之一。但是，DIF对水产动物的急性毒性、组织损伤等情况目前尚且不清楚。因此，本文拟通过研究DIF对异育银鲫急性毒性、在肝脏、肾脏组织中的残留以及所引起的损伤等情况，为其在水产养殖上的合理使用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 健康的异育银鲫购自于江苏省南通市某农场，体质量为(60.04±5.02)g，运至实验室经2%NaCl浸泡消毒10 min后，暂养2周。试验用水族箱规格为100 cm×80 cm×80 cm。试验用水为充分曝气的自来水;连续24 h充气;每两天换1次水，每次换水量1/4。暂养及毒性试验期间控制水温为(18±1)℃;自然光照。

1.1.2 主要仪器 超纯水系统(Purelab Prima120)、精密电子天平(Mettler AB104-N)、切片机(Leica:RM2135)、展片机(Leica:HI1210)、显微镜(Olympus)、高速冷冻离心机(Allegrax-15R)、Agilent-1100型高效液相色谱仪(四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)、氮气吹干仪、漩涡混合器等。

1.1.3 主要试剂和药品 苦味酸、甲醛、氯仿、石蜡、冰醋酸、苏木精、伊红、盐酸、无水乙醇、二甲苯、中性树胶和水杨酸、氯化钠、二氯甲烷、正己烷、柠檬酸、柠檬酸三钠、磷酸、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠为国产分析纯;乙腈、四丁基溴化铵为HPLC级(由国药集团化学有限公司购进);DIF标准品购自Sigma公司;DIF原料药(纯度为98%)由浙江国邦药业有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性试验 预试验根据《新兽药特殊毒性试验技术要求》设计，DIF采用单次前肠口灌给药。根据在最低剂量组的试验鱼死亡率小于20%，最高剂量组的试验鱼全部死亡或者死亡率大于80%原则，通过预试验得到正式试验的药物用量区间(最低与最高剂量)范围;再根据确定的区间范围利用等对数间距法［13］确定各正式急性毒性试验组的用药剂量。正式急性毒性试验分5个剂量组，每个剂量组分3个平行，共30尾。试验鱼发生死亡判断标准:呼吸停止并对外界刺激无反应，即中毒后鳃盖完全停止活动且鱼体对外界(如玻璃棒或镊子)刺激在30 s内没有产生反应确定为死亡［14］。

1.2.2 样品采集 根据本文得到的96 h LD50单次前肠口灌用药;试验分为3个平行，每个平行30尾;并于用药后第96 h采集肝脏和肾脏组织样品用于药物残留和组织切片分析。

1.2.3 药物残留检测 (1)色谱条件。色谱柱为:ZORBAX SB2C-18分析柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);检测波长278 nm;流速1.5 mL/min;柱温 40 ℃;流动相:乙腈:四丁基溴化氨(0.030 mol/L、pH3.1)=5:95(V/V);进样量为 10 μL。

(2)HPLC样品处理［15］。用10 mL离心管分别称取肝脏、肾脏组织匀浆1.000 g，先加入0.2 mol/L PBS缓冲溶液(pH 7.4)和1 mol/L NaCl各1 mL，再加入5 mL二氯甲烷进行药物萃取，旋涡混合振荡10 min后，4℃条件下8 000 r/min离心10 min，取有机相;剩余残渣中再加入5 mL二氯甲烷，重复上述操作步骤进行第二次萃取;合并上述两次有机相，置于氮气吹干仪中45℃恒温吹干，然后加1 mL流动相溶解，再加5 mL正己烷脱脂;混匀、离心后将下层液体经有机微孔滤膜(0.45 μm)过滤，4℃保存。

(3)DIF检测方法确证。DIF检测方法的正确性见“双氟沙星对异育银鲫血脑屏障渗透性及消除规律”一文［16］。

1.2.4 组织切片 取新鲜肝脏和肾脏组织，10%福尔马林浸泡48 h以上;然后将固定好的肝脏和肾脏组织切成小块，依次进行组织脱水、透明、透蜡包埋、切片(厚度:6 μm)，再用苏木精-伊红染色［17］，中性树胶封片后在显微镜下观察、拍照。

1.3 数据处理

DIF半数致死量按照下列公式计算:

其中:Xk为最高对数剂量;i为相邻两对数剂量的差值;∑P为各剂量组的死亡率之和;Pm为最高剂量死亡率;Pn为最低剂量死亡率。

文中数据以平均值±标准差表示，并运用SPSS17.0进行一维方差分析，其中P＜0.05和P＜0.01表示差异显著和差异极显著。

2 结果与分析

2.1 96 h半数致死剂量

预试验得到DIF急性毒性正式试验时的药物用量区间为2 000～4 000 mg/kg。因此，依据等对数间距法得到 5 组正式急性毒性试验剂量分别为 2 000、2 378.209、2 828.134、3 363.179 和 4 000 mg/kg。然后在根据上述5个剂量进行前肠单次口灌给药后，各剂量组实验鱼死亡时间及死亡数量见表1。另根据1.3中DIF半数致死量公式计算得到DIF对异育银鲫96 h半数致死剂量为2 840 mg/kg，DIF应为安全剂量284 mg/kg。

表1 DIF对异育银鲫急性毒性试验结果Tab.1 Acute toxicity test results of DIF to C.auratus gibelio

2.2 DIF 临床症状

DIF按照上述5个剂量进行前肠单次口灌给药后，各剂量组实验鱼均先后出现焦躁不安、快速游动、乱窜、呼吸频率加快且不规则等异常现象;并且随着试验时间的增加，各组实验鱼表现侧翻、甚至呈现“腹上背下”或者“头上尾下”等异常体态，有的体形发生“弯月状”变形;有的胸鳍、腹鳍还出现僵直、震颤等类似神经异常症状。另外，实验鱼在96 h LD50剂量下(2 840 mg/kg)也出现上述症状。实验鱼在96 h LD50剂量下，异育银鲫在用药后16 h开始表现急躁不安、呼吸频率加快、快速游动并上浮;49 h左右体态出现侧翻，呈弯月形，出现“头上尾下”等异常体态，随着用药时间的增加，有些异育银鲫表现出上述相似的异常神经症状。

2.3 DIF组织残留情况

采用HPLC对肝脏、肾脏组织中DIF残留检测结果显示，在DIF 96 h LD50剂量下，DIF在肝脏组织中的含量为(73.36±2.17)μg/g，极显著高于肾脏组织中的残留量(4.33±0.35)μg/g。

图1 96 h肝脏病理组织切片(DIF 96 h LD50)Fig.1 Histopathological section of liver at 96h(DIF 96 h LD50)

图2 正常肝脏组织切片Fig.2 Tissue section of normal liver

图3 96 h肾脏组织病理切片(DIF 96 h LD50)Fig.3 Histopathological section of kidney at 96 h(DIF 96 h LD50)

图4 正常肾脏组织切片Fig.4 Tissue section of normal kidney

2.4 DIF对肝脏、肾脏组织病理损伤情况

组织切片结果显示，DIF根据其96 h LD50(2 840 mg/kg)用药后，肝细胞之间的界线较为清晰;但细胞核变形严重呈星状，核仁浓缩、破裂甚至溶解消失(图1白箭头所示);细胞质染色较浅，有些发生崩解;部分肝细胞发生空泡变性(图1黑箭头所示);而正常肝细胞形态完整、界限清晰，细胞核染色均匀(图2白箭头所示);细胞质清晰、嗜酸性强;肝血窦典型(图2黑箭头所示)。肾脏在其96 h LD50用药后呈现血管球轻微皱缩，出现囊腔，结缔组织有出血(图3白箭头所示);肾小管结构不完整，其上皮细胞界线模糊，细胞核溶解(图3黑箭头所示)等病理变化;而正常肾脏肾小球结构完整(图4白箭头所示);肾小管形态清晰(图4黑箭头所示)。

3 讨论与结论

3.1 DIF对异育银鲫毒性

目前，关于DIF毒性也有很多研究。张艳等［18］研究表明，盐酸二氟沙星混悬乳注射液对小鼠口服LD50为2 303.56 mg/kg，对小鼠腹腔注射LD50为723.89 mg/kg，按照外源化合物急性毒性分级标准判断属于低毒物质。沈川等［19］研究认为，双氟沙星在剂量分别为500、50、5 mg/kg时对昆明系小鼠的生殖细胞染色体均未造成损伤，其显性致死试验为阴性。黄文颐等［11］按300、150、50 mg/kg的盐酸二氟沙星给受孕大鼠灌胃，结果高剂量组胎鼠存活率明显降低，显著影响了胚胎的生长发育，且其严重程度存在剂量效应关系。本文中所得到的DIF对异育银鲫(平均体质量为(60.04±5.02)g)96 h LD50为2 840 mg/kg。根据我国《生物技术检测规范(水环境部分)》毒性分级标准判断，DIF对异育银鲫为低毒物质。

另据报道，FQNS常见的毒副作用主要包括中枢神经系统毒性、肝脏毒性、肾脏毒性、软骨毒性、及生殖毒性等［2-4］，其中中枢神经系统毒性为喹诺酮类药物常见的不良反应。经统计分析，临床上最多见的是神经毒性［5］。FQNS引起的神经毒性主要表现为惊厥、昏迷、癫痫等［6-8］。动物表现为不安或神经症状，雏鸡急性中毒神经症状表现为尖叫、旋转、最后头颈及两肢强直、痉挛而死，猫、犬还能诱发癫痫［20］。邓艳萍［9］研究发现，在小鼠脑内注射环丙沙星、依诺沙星、司巴沙星与氧氟沙星等5种氟喹诺酮类抗菌药能引发惊厥作用。张艳等［18］对小鼠灌服盐酸二氟沙星混悬乳注射液后，各组小鼠均出现扭体、竖尾、全身震颤、抽搐等症状。本文DIF急性毒性试验中，异育银鲫按照其96 h LD50单次前肠口灌给药后，于第16 h开始表现急躁不安，呼吸频率加快且不规则，快速游动并上浮等异常现象;在第49 h左右出现体态侧翻呈弯月形，在水中呈“头上尾下”的异常体态，随着用药时间的增加，有些异育银鲫表现“腹上背下”等异常体态，同时胸鳍和腹鳍呈僵直、震颤等类似神经异常症状。上述临床症状表明，DIF对异育银鲫具有神经毒性。

有研究表明，FQNS神经毒性与其能竞争性抑制神经递质γ-氨基丁酸(Gama-Aminobutiric acid，GABA)与GABA受体结合有关。有研究认为，FQNS致癫痫机制是通过阻止GABA与神经细胞相应的受体结合而致脑神经细胞的兴奋抑制调节失调［21-22］，使CNS兴奋性增高［23］。FQNS在脑脊液中的浓度增高，使得GABA从自主神经末梢释放减少的同时，还可以竞争性抑制GABA与突触后受体结合，使CNS兴奋性增加，导致惊厥和癫痫等不良反应的发生［24］。FQNS神经毒性可能是由于FQNS药物含有氟原子(使其亲脂性增加，组织渗透力增强)，容易通过血－脑屏障进入脑组织及神经细胞内，使GABA释放减少，进而使CNS兴奋性增高所致。另外有研究认为，FQNS引起轻度的神经毒性反应具有可逆性［25］，停药后一般可恢复。

3.2 DIF对异育银鲫组织损伤

FQNS除了中枢神经系统毒性之外、肝脏毒性、肾脏毒性、软骨毒性及生殖毒性也是其常见的毒副作用。有研究发现，左氧氟沙星能引起肝脏损害［26］，曲伐沙星可导致急性肝炎［27］。荣祖元等［28］在研究环丙沙星、依诺沙星、氧氟沙星等氟唆诺酮类药物对小鼠腹腔注射急性毒性试验中发现，上述药物在低于1/2～1/4LD50剂量作用下能引起小鼠肝脏重度畸型，出现空泡样变，并有散在灶性坏死。FQNS通常浓集于肾脏，可通过各种机制引起肾脏损害如直接损害肾小管、间质性炎症(过敏性间质性肾炎)、肾电解质水平改变或肾小球损害［29］。另外有研究发现，FQNS常引起过敏性间质性肾炎［30］。邓宇等［31］研究发现，左氧氟沙星对家兔的前交叉韧带细胞具有明确的毒性作用，同时认为该作用与氟喹诺酮类药物对肌腱的细胞毒性作用相类似。因此，本文研究了96 h LD50剂量下DIF在肝脏、肾脏组织中的残留及组织损伤情况。结果显示，在96 h LD50(2 840 mg/kg)剂量下，DIF在肝脏和肾脏组织中的残留量分别为(73.36±2.17)μg/g 和(4.33±0.35)μg/g(表 2)。同时，病理组织切片观察发现，DIF 根据其 96 h LD50用药后，肝脏细胞核变形严重呈星状，核仁浓缩、破裂甚至溶解消失，细胞质染色较浅，有些发生崩解;部分肝细胞发生空泡变性(图1);肾脏出现血管球轻微皱缩出现囊腔，结缔组织出血，肾小管结构不完整，其上皮细胞界线模糊，细胞核溶解等病理变化(图3)。上述组织病理观察结果表明，在96 h LD50剂量下，DIF对异育银鲫的肝脏、肾脏产生了严重毒性。

本文研究了DIF对异育银鲫的急性毒性和对在肝脏、肾脏组织中的残留以及所引起的组织损伤等情况。虽然急性毒性试验结果认为DIF对异育银鲫为低毒物质，但从其所致临床症状来看，DIF对异育银鲫具有神经毒性，同时对异育银鲫的肝脏、肾脏产生了严重毒性。本文的研究结果为DIF在水产养殖上的合理使用提供了理论参考。

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