制动致福利损伤大鼠肝细胞中NF-κB的表达

梁 磊，马 畅，刘 捷，董 敏，方 天，胡文娟，陈 莉，贾春梅，恽时锋

（南京军区南京总医院比较医学科，全军实验动物科普与伦理教育基地，全国科普教育基地，南京 210002）

制动致福利损伤大鼠肝细胞中NF-κB的表达

梁 磊，马 畅，刘 捷，董 敏，方 天，胡文娟，陈 莉，贾春梅，恽时锋

（南京军区南京总医院比较医学科，全军实验动物科普与伦理教育基地，全国科普教育基地，南京 210002）

目的研究制动导致的福利损伤大鼠肝细胞内NF-κB的表达变化。方法选取±170g SD大鼠，雌雄各半，使用制动的方式造成其福利损伤，记录实验过程中的体增重和饲料消耗，而后分别使用实时定量PCR和免疫印迹法检测大鼠肝细胞内NF-κB p65的mRNA量和蛋白表达水平。结果与对照组相比，制动组大鼠的体增重和饲料能耗比均降低，且差异极显著（P＜0.01）；肝细胞中NF-κB p65的mRNA量和蛋白表达水平均大幅提升，同样差异极显著（P＜0.01）。其中制动组雄性大鼠的NF-κB p65的mRNA量和蛋白表达水平显著高于雌性（P＜0.05），但对照组大鼠的雄性与雌性之间未表现出差异（P＞0.05）。结论大鼠福利受损时，肝细胞中NF-κB表达水平大幅提升，提示两者之间存在一定关联，表明NF-κB参与了大鼠福利损伤过程。

福利损伤；NF-κB；基因表达

实验动物福利是动物实验研究中的一个重要问题，因为福利受损的动物达不到“康乐”状态［1］，不是标准的实验动物。其生存质量下降，机体各系统状态紊乱，会对动物实验研究的进行造成影响，降低实验结果的可靠性［2］。但对于实验动物福利水平的评估尚缺乏直接的、具代表性的指标。NF-κB（nuclear factor-kappaB，核因子-κB）是一类广泛存在于哺乳动物的各种组织和细胞中的调控因子，在介导机体应激反应尤其是炎性反应的过程中起关键作用，多种因素―应激、毒素、感染、LPS、TNF-α、放射性物质等―均可刺激其活化，使其表达水平上调［3-4］。而动物实验中的各类干预因素对实验动物来说都是应激刺激，符合NF-κB的活化条件。因此，本研究使用动物实验中常用的SD大鼠，通过束缚制动以降低其福利水平［5］，观测其肝组织中NF-κB表达水平的变化，探寻实验动物福利与NF-κB之间的联系。

1 材料和方法

1.1 实验动物与饲育环境

SD大鼠32只，雌雄各半，体重±170g，由南京军区南京总医院比较医学科提供【SCXK（军）2012-0014】，实验场所为南京军区南京总医院比较医学科屏障环境【SYXK（军）2012-0047】。Co60灭菌全价饲料与高温高压灭菌饮用水，自由采食。

1.2 实验分组与福利损伤模型建立

SD大鼠随机挑选并分组如下（n=8）：

对照组雄（control male，CM）：雄性SD大鼠，正常饲养。

制动组雄（restrain male，RM）：雄性SD大鼠，每日9：00～10：00、15：00～16：00各使用圆筒形容器束缚制动1h，制动程度为大鼠不感觉压迫但无法自由活动，干预时间为4周。

制动组雌（restrain female，RF）：雌性SD大鼠，干预过程同RM组。

1.3 试剂及仪器

反转录试剂盒（TaKaRa，#RR047A），PCR仪（MJ research，PTC 200），荧光定量PCR检测系统（Roche LightCyclery 96）；一抗10745-1-AP p65 antibody（Proteintech），二抗山羊抗兔-HRP（santa cruze），Protein Marker（Takara），Acr、Bis、Tris（Sigma），TEMED、Gel Doc2000成像系统、垂直电泳系统（BIO-RAD）。

1.4 指标测定

1.4.1 实验过程中记录各组大鼠体重变化及进食量，实验结束计算体增重和饲料能效比：

体增重=实验结束体重-初始体重

The stability simulation and evaluation about massive karst cavern of Zhushabao tunnel on

饲料能效比（food efficiency ratio，FER）=体增重/总进食量×100％

1.4.2 实时荧光定量PCR检测NF-κB p65 mRNA含量

取大鼠肝脏组织，充分裂解后按Trizol操作说明提取总RNA。反转录体系为20μL，每管加入总RNA4μg，按照TaKaRa#RR047A反转录试剂盒说明操作，37℃反应1h，70℃15min。反转录后的cDNA用于实时定量PCR反应，引物由南京申兴医学技术有限公司合成，p65上游引物5′-TCACCAAA GACCCACCTCACCG-3′，下游引物5′-GGACCGCA TTCAAGTCATA GTCCC-3′，扩增片段长度243bp，退火温度60℃；GAPDH上游引物5′-ATCATCTCCG CCCCTTCTGC-3′，下游引物5′-GCCTGCTTCACCA CCTTCTT-3′，扩增片段长度437bp，退火温度57℃。反应体系：SYBR Premix Ex Taq II（2×）10μL，cDNA2μL，上、下游引物各1μL（10μmol/L），加入Nuclease-Free Water至20μL。反应条件：95℃预变性3min，（95℃10s，60℃60s）×40个循环，每个样品3次重复。将对照组雄性大鼠基因表达水平定为1，分析其他组别的基因表达差异。

1.4.3 Western blot检测NF-κB p65蛋白表达

取肝脏组织，裂解细胞提取总蛋白。10％SDSPAGE凝胶电泳，蛋白转至PVDF膜，5％脱脂牛奶封闭，一抗4℃过夜，二抗37℃反应1h，洗膜ECL显影。以GAPDH为内参照，每组样本进行3次重复。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 体增重与饲料能效比较

如表1所示，制动组大鼠无论雌雄其体增重数据均远低于同性别对照组大鼠，且差异极其显著（P＜0.01）；制动组大鼠的饲料能效（food efficiency ratio，FER）数据也与同性别的对照组大鼠有较大差距，其中雄性制动组大鼠FER数据差异显著（P＜0.05）。

2.2 基因表达

实时荧光定量PCR目的基因NF-κB p65和内参GAPDH的标准曲线线性良好，引物扩增效率为99.8％。结果如图1所示，无论雌雄，制动组大鼠的该基因表达量远远高于对照组。数据分析表明，与对照组大鼠相比，制动组大鼠的该基因表达显著升高（P＜0.01）。但制动组不同性别大鼠之间表达量也存在显著差异（P＜0.01），对照组不同性别大鼠之间未显示出统计学差异。

表1 各组大鼠体增重与饲料能效比Tab.1 Body weight gain and food efficiency ratio of different groups

注：**表明与同性别对照组比较，P＜0.01；##表明与同组别雄性相比，P＜0.01（n=8）。图1 各组大鼠肝细胞NF-κB p65基因表达Note：**means compare with control group，P＜0.01；##means compare with male，P＜0.01（n=8）.Fig.1 Gene expression of NF-κB p65 in liver of different groups

2.3 蛋白表达

图2 各组大鼠肝细胞NF-κB p65蛋白表达Fig.2 Expression of NF-κB p65 in liver of different groups

Western Bolt结果如图2所示，制动组大鼠肝细胞中NF-κB p65蛋白表达水平高于对照组大鼠。表2将各组大鼠蛋白相对表达量进行了统计分析，表明制动组大鼠蛋白相对表达量显著高于对照组大鼠（P＜0.01）。同组别雄性大鼠的相对表达量均高于雌性大鼠，其中制动组的差异显著（P＜0.05），但对照组的差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠肝细胞NF-κB p65表达统计结果Tab.2 The statistical results of NF-κB p65 expression in liver of different groups

3 讨论

动物实验中的各种处理因素对实验动物造成的身心创伤及其累积效应是主要的福利损害［6］，本实验中正是使用反复制动来模拟正常实验过程中的抓取与保定过程，以试图对实验动物福利造成损害。制动术目前广泛应用于身心压力引发各类动物损害的实验研究中［5］，是一种较为常用的轻度福利损害手段。结合本实验中的数据，制动组大鼠的体增重和饲料能耗均显著低于对照组大鼠，可以认为制动组大鼠已经福利受损。

NF-κB是1986年Sen和Baltimore［7］在B淋巴细胞中发现的一类能和免疫球蛋白κ轻链基因的增强子特异结合的核因子，广泛存在于各种真核细胞中。它由两类Rel家族亚基组成，活性DNA结合形式是两类亚基的同源或异源二聚体，其中以P50和P65组成的二聚体最为常见［8］。当受到如应激等细胞外信号的刺激时，经过一系列连锁的酶促反应，IκB（核因子-κB抑制蛋白）从NF-κB三聚体上解离下来，从而使NF-κB二聚体活化、入核，启动特异靶基因的转录和表达［9-11］。它在调控炎性因子、细胞因子、粘附分子等的表达，免疫应答及细胞增殖、分化、凋亡的过程中均起关键作用［12-13］。其中经NF-κB介导调控的多种因子如TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6均可促进机体的炎性反应，产生机体损伤。通常情况下，当福利水平下降时动物往往表现出毛色不顺、食欲下降、免疫抑制、代谢及内分泌紊乱等一系列问题，本实验中，对照组大鼠NF-κB仅轻微表达，但制动组大鼠经制动处理后福利受损，NF-κB表达水平显著上调，其中制动组雄性大鼠的基因表达量甚至到达了相应对照组大鼠的近14倍之多，表明了NF-κB极有可能在这一系列过程中产生了作用，即NF-κB参与了福利损伤及其导致的机体内功能紊乱过程。

对多种动物的观察和研究表明，动物的福利水平表现为动物在适应环境改变过程中付出的生物学代价，评价这一生物学代价必须综合考虑动物外观、行为模式、生长发育水平、特异性和非特异性免疫力、神经内分泌反应以及器官组织病理等多个指标的变化［14］。因此，我们在评估动物福利水平变化时大都要综合分析行为学、生长发育、免疫及神经内分泌等多方面指标。但这些指标已经是福利水平降低所引发的一系列复杂的信号传导、调控的终末表现，当我们观察到这些指标时就表明福利损害已经发生，实验动物的福利水平已经受到了影响。NF-κB是一种广泛存在于组织和细胞中，能介导机体应激反应的关键调控因子，在机体的应激反应过程中发挥重要的作用，而本研究所探讨的福利损伤其本质是实验因素的身心压力累积而对实验动物形成的一个慢性应激过程，引发福利损伤的因素恰属于NF-κB的激活因素。并且NF-κB是一种上游调控因子，相对于能较早的提示福利损伤的发生。

根据本次实验的结果，我们认为NF-κB有可能作为一个具代表性的福利衡量指标，用以评估实验动物福利损害，但通过本次实验我们也发现了若干问题。首先，制动组雄性大鼠的NF-κB水平不但显著高于对照组，同时与同组的雌性大鼠也存在统计差异。经我们研究发现，其原因可能有2个方面：一是由于雌性大鼠生长速度低于雄性，相对于束缚容器而言体型较小，导致其束缚效果不如雄性大鼠，从而导致了表达水平的差异；二是由于性别差异，杜晓辉等［15］的研究表明，性别差异对脓毒症大鼠肝脏NF-κB活化具有影响，雌性大鼠的NF-κB、TNF-α及ALT的变化均显著低于雄性。自然界中雌性个体对于应激等因素的耐受性往往要强于雄性个体，在本实验中的表现也是如此。由此可见性别和干预因素对于NF-κB的表达具有很大的影响，这也引发了我们对于动物实验中性别选择的思考。同时本实验使用的制动术是经过大量实验研究论证的，其福利损伤效果目前已被广泛接受。若实验动物经其他因素处理，NF-κB与福利水平是否仍有关联？其次，NF-κB要成为一个具代表性的福利衡量指标，并且要及早提示福利损伤的发生，那么NF-κB能否于行为学、免疫、内分泌等指标变化之前发生显著变化，同时NF-κB与行为学、免疫、内分泌等指标之间是否具有相关性，我们仍不得而知。除此之外，根据嵇晴等［16］的研究，特定剂量的氯胺酮可以抑制NF-κB的活性，减少TNF-α的释放，有益于机体恢复。那么我们设想既然NF-κB参与了福利损伤过程，那么当我们使用抑制剂抑制NF-κB的表达时，能否缓解福利损伤情况？因此，要明确NF-κB能否成为一个具代表性的福利衡量指标，我们仍有很多工作要做，许多问题仍有待进一步研究论证。

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The study of expression of NF-κB in rats’liver after welfare impaired by restrain stress

LIANG Lei，MA Chang，LIU Jie，DONG Min，FANG Tian，HU Wen-juan，CHEN Li，JIA Chun-mei，YUN Shi-feng
（Department of Comparative Medicine，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Army Education Base of Science and Ethics of Experimental Animal，National Sciene Education Base，Nanjing，210002，China）

ObjectiveTo study the expression of NF-κB in rats’liver after welfare impaired by restraint stress.MethodsSD rats，±170 g，male and female half，welfare were impaired by restraint stress.Body weight gain and food consumption were recorded throughout the study，mRNA and protein expression of NF-κB p65 in liver were detected after the study finished by real-time quantitative PCR and Western blotting.ResultsCompared with the control group（group C），the body weight gain and food efficiency ratio（FER）of restraint group（group R）were decreased（P＜0.01），but mRNA and protein expression of NF-κB p65 were much higher（P＜0.01）.Compared with female，mRNA and protein expression of NF-κB p65 of male rats were much higher in group R（P＜0.01），but showed no significant difference in group C（P＞0.05）.ConclusionAfter welfare impaired，the expression of NF-κB in rats’liver are much higher than before.It shows that NF-κB has effects during the process of welfare being impaired.

Welfare impaired；NF-κB；Gene expression

R-332

A

1671-7856（2015）11-0028-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2015.11.007

梁磊（1982-），男，技师，理学学士，研究方向：实验动物福利伦理，人类疾病动物模型。

恽时锋（1965-），男，主任技师，博士，硕士生导师，研究方向：实验动物与比较医学，E-mail：yunshifeng1@163.com。

﹞2015-09-16