骨髓间充质干细胞移植对血管性痴呆大鼠认知功能的影响

黑悦樊才瑞龙乾发罗强魏礼洲伊西才刘卫平

·基础研究·

骨髓间充质干细胞移植对血管性痴呆大鼠认知功能的影响

黑悦1樊才瑞2龙乾发3罗强3魏礼洲1伊西才1刘卫平1

目的 探究骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对血管性痴呆大鼠认知功能及海马CA1区域GAD67、GABABR1的表达的影响。 方法 成年雄性SD大鼠60只随机分为假手术组 (n= 20)，模型组(n=20)和移植组(n=20)。结扎双侧颈总动脉建立大鼠血管性痴呆模型，2 h后BMSCs尾静脉移植，28 d后水迷宫检测认知变化，Western blotting和免疫组化分析大鼠海马CA1区GAD67和GABABR1的表达变化。 结果 (1)Western blotting和免疫组化结果显示，模型组相比假手术组在慢性期海马CA1区GAD67和GABABR1表达水平(蛋白水平以及免疫组化染色强度)下调，差异具有统计学意义 (分别为1.347±0.357比2.237±0.956，t=5.478，P=0.0076；0.779±0.181比1.691±0.337，t=4.893，P=0.0073)。(2)移植组GAD67和GABABR1表达水平改变均比模型组轻微，差异具有统计学意义(分别为1.611±1.007比1.347±0.357，t=2.379，P=0.0373；1.009±0.257比0.779±0.181，t=2.678，P= 0.0441)。(3)水迷宫认知功能测试显示，移植组比模型组潜伏期缩短(20.817±2.891比30.192±3.472，t= 2.743，P=0.0442)，且在游泳轨迹方面显示出更好的方向性。 结论 BMSCs移植可提升血管性痴呆大鼠认知功能并上调海马CA1区GAD67和GABABR1表达水平。

骨髓间充质干细胞； 血管性痴呆； 细胞移植； GAD67； GABABR1

近年来血管性痴呆 (vascular dementia，VaD)相关认知功能障碍在动物模型中被证实与慢性全脑缺血相关[1-2]。永久性双侧颈总动脉结扎(two vessel occlusion，2VO)在皮层和海马区域都造成了显著而持续的低灌注，被广泛运用于血管性痴呆认知功能的研究之中[3-4]。而海马CA1区椎体神经元是2VO引起的认知功能障碍重要靶点，而其中γ氨基丁酸能系统(GABAergic system)的选择性调控对认知改善有十分积极的作用[1,5,6]。抑制性神经元中GAD67的表达和突触中GABABR1的表达是该系统的重要组成部分[7-9]，分别在GABA神经递质的合成和功能发挥中扮演重要角色，并且两者的调控能够引起细胞外GABA水平和认知功能的改变[7,9]。然而BMSCs能否通过调控GAD67和GABABR1的水平仍未可知。本研究拟利用2VO模型探究BMSCs移植对认知功能的改善，以及对海马CA1区域GABA能系统重要靶点GAD67和GABABR1表达的影响。

材料与方法

一、实验动物和分组

全部健康成年Sprague Dawley(SD)大鼠(雄性，230～250 g)60只，由第四军医大学实验动物中心提供。实验动物随机分为假手术组(n=20)，模型组(n= 20)和移植组(n=20)，后续处理中如有死亡或者造模不成功则另行补充。

二、大鼠血管性痴呆模型的制作

造模前适应性喂养1周，术前12 h禁食，采用2VO制作大鼠血管性痴呆模型。大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 mg/kg)，仰卧位固定，于颈部正中做1.5 cm切口，暴露并分离双侧颈总动脉，注意尽量不牵扯迷走神经，取7号线于颈总动脉近远心端做2处方结，做永久性结扎。术后6 h以Longa五级四分法[10]评分为1～3分者为模型建立成功。

三、骨髓间充质干细胞培养和移植

取2周龄SD雄性大鼠，腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 mg/kg)后浸泡在75%酒精中15 min，取出双侧股骨骨髓，用5 ml生理盐水反复冲洗后收集5 ml骨髓液，2 500 r/min离心20 min，生理盐水洗2遍后 加 入 基 础 培 养 基 (alpha-minimum essential medium，α-MEM)，10%胎牛血清(FBS，Hyclone，USA)接种于25 ml塑料培养瓶，放入37°C，5%CO2的孵箱中静置培养48 h后换液。细胞铺满培养瓶平底80%左右时用胰酶消化传代。取第三代骨髓间充质干细胞待用。模型建立2 h后，腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 ml/kg)，经尾静脉注射1 ml浓度为1×107个第三代骨髓间充质干细胞，模型组和假手术组经尾静脉注射1 ml生理盐水。

四、行为学分析

水迷宫测试一共分为两步。首先连续4 d进行定位航行，各组大鼠(n=5)进行平台寻找训练，每天分别从4个象限固定的位置入水，时间限定为60s，各象限之间间隔15 s，记录大鼠分别从4个象限不同入水点找到平台所需的时间，即游泳潜伏期(4次游泳潜伏期平均值)。若其没有找到平台，则记为60 s，同时仍使大鼠站在平台上15 s。而后是空间探索测试，在第5天将平台撤去后记录大鼠从4个象限不同入水点到平台的游泳轨迹(左上是目标象限，平台所在位置用圆框标注)。时间设定为60 s，其余相同。

五、大鼠脑组织标本制备及GAD67、GABABR1免疫组化染色

模型建立后第28天取大鼠(模型组、移植组各6只和假手术组5只)，用200 ml生理盐水灌注后用4%多聚甲醛灌注固定。常规石蜡包埋，冠状切片(厚度为2 mm)。石蜡切片常规脱蜡止水，pH 6.0的柠檬酸修复液进行抗原修复；磷酸盐缓冲液(phosphate bufferedsaline，PBS)漂洗3次，每次6 min；加入0.3%H2O2溶液封闭内源性过氧化酶15 min；PBS漂洗3次，每次6 min；加入驴血清封闭1 h后甩去血清分别加入GAD67(1∶800，Sigma，美国)GABABR1 (1∶400，Abcam，美国)抗体，在4°C冰箱中孵育过夜，洗脱。滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，室温孵育2 h。二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)染色，自来水冲洗，苏木素复染，常规脱水透明并封片，光镜下分析计数。

六、大鼠海马CA1区域GAD67、GABABR1的Western blotting检测

各组大鼠(模型组、移植组各6只和假手术组5 只)麻醉状态下经左心室持续灌注200 ml 0．01 mol／L PBS后，在冰上断头轻柔分离大鼠海马CA1组织加入强效组织裂解液1 ml提取蛋白，进行蛋白定量(西安鼎国)。配制10%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)，按80 μg总蛋白上样量上样，5%浓缩胶、10%分离胶电泳后，100 V电压2 h将蛋白转移到硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC膜)上，丽春红染色预染条带，1×三乙醇胺缓冲盐水溶液 (tris buffered saline and tween，TBST)洗3×5 min，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，1× TBST洗3×5 min。而后使用GAD67(1∶800，Sigma，美国)GABABR1(1∶400，Abcam，美国)抗体在4°C冰箱中孵育过夜，加入二抗后辣根过氧化物酶显色。使用计算机-荧光扫描仪系统扫描底片而后用Image J统计分析。

七、统计学分析

所有定量数据均以均数±标准误(x±SE)表示，应用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析。双因素方差分析用于水迷宫各参数分析，单因素方差分析用于检测GAD67和GABABR1的表达水平。以P<0.05为有统计学意义。

结果

一、水迷宫实验结果

2VO模型造模并移植BMSCs 28 d后，对三组(模型组，移植组和假手术组，各组n=5)进行为期5 d的水迷宫测试(图1)。模型组相比假手术组的游泳潜伏期有明显差距。模型组在训练的3 d游泳潜伏期相比假手术组显著上升(第2天44.167±2.313对比30.933±1.572，t=3.953，P=0.0341；第3天41.732± 2.372对比22.969±4.372，t=5.387，P=0.0181；第4天30.192±3.472对比14.300±3.157，t=4.690，P=0.0041)，而BMSCs移植后在移植组的表现则相比模型组更好(第3天33.165±1.777对比41.732±2.372，t=2.325， P=0.0372；第4天20.817±2.891对比30.192±3.472，t=2.743，P=0.0442)。而在随后的空间探索测试中，移植组相比模型组在游泳轨迹方面显然拥有更好的方向性(图2)。

图1 大鼠水迷宫实验的逃避潜伏期

二、免疫组化实验结果

随机选取各组大鼠(模型组、移植组各6只，假手术组5只)进行海马CA1区GAD67和GABABR1免疫组化染色切片，在光镜下计数至少10个以上的高倍视野(200×)进行统计分析(图3)。模型组相比对照组GAD67(7.347±0.937对比21.544±1.333，t= 4.377，P=0.0053)和 GABABR1(5.374±0.057对比14.007±1.593，t=8.949，P=0.0007)染色强度明显下降。相比模型组，移植组不同程度地上调了GAD67 (11.911±1.131对比7.347±0.937，t=3.992，P=0.0426) 和GABABR1(7.527±1.037对比5.374±0.057，t=4.012，P=0.0361)受体的表达。

三、Western blotting实验结果

图2 大鼠水迷宫实验的游泳轨迹

图3 GAD67和GABABR1的免疫组化染色结果

与免疫组化结果相对应，大鼠(模型组、移植组各6只，假手术组5只)海马CA1区GAD67和GABABR1蛋白水平也呈现相应的变化(图4)。模型组相比假手术组，海马CA1区GAD67(1.347±0.357对比2.237±0.956，t=5.478，P=0.0076)和GABABR1 (0.779±0.181对比 1.691±0.337，t=4.893，P=0.0073)蛋白水平显著下降。而相比模型组，移植组GAD67 (1.611±1.007对比 1.347±0.357，t=2.379，P=0.0373) 和GABABR1(1.009±0.257对比0.779±0.181，t= 2.678，P=0.0441)表达水平明显上调。

讨论

图4 GAD67和GABABR1的Western blot结果

血管性痴呆为老年痴呆的主要类型之一，其认知障碍由脑组织血液循环障碍引起[1]，而2VO手术能够很好复制疾病机制，引起血脑屏障破坏、认知功能下降以及神经元损伤等[4]，是近年来使用频率最多且被广泛认可的血管性痴呆动物模型之一。本研究发现在血管性痴呆大鼠造模28 d后，水迷宫测试(无论定位航行或者空间探索测试)模型组的表现比假手术组更差，提示2VO模型能够复制认知缺损。与此同时，GABA能系统缺陷在阿尔兹海默氏病，癫痫以及慢性缺血性脑损伤中都有报道[9,11,12]，本研究证实了海马GABA能系统中GAD67和GABABR1 在2VO造模后慢性期(28 d)蛋白水平以及免疫组化染色强度明显下降(尤其是在CA1区)，提示CA1区GABA能系统可能是血管性痴呆相关认知缺陷的重要靶点。

前期研究发现大鼠2VO模型中BMSCs移植后能够穿透血脑屏障，迁移到损伤的皮层，纹状体以及海马区域[13]，最终促进神经元、血管再生和认知功能改善[14-16]。BMSCs由于其易于分离扩增、多向分化、低免疫原性特征，在缺血性脑损伤中有巨大的治疗潜力，然而有关于BMSCs治疗的机制仍未明晰[17]。近年来不断有研究发现虽然BMSCs在体内定向分化的能力有限，但能够以旁分泌的方式释放GABA，VEGF和NGF等营养因子[18,19]，在体外能够直接提升共培养的海马神经元GABA能神经传导水平[20]，在体内能够调节局部的微环境并促进神经修复、血管再生[13]。GABA能中间神经元大量存在于海马CA1区椎体神经元中，并且对认知功能有重要作用。本实验发现在大鼠血管性痴呆模型慢性期，BMSCs移植后海马CA1区域GABA能系统中重要靶点(GAD67、GABABR1)的表达水平相比模型组不同程度上调，水迷宫认知能力测试亦发现移植组的表现比模型组展现出更好的认知能力，提示BMSCs移植对血管性痴呆相关认知改善可能是通过上调海马CA1区域的GAD67和GABABR1的表达进行的。

综上所述，本实验通过建立大鼠双侧颈总动脉结扎的血管性痴呆模型，探讨了BMSCs移植对血管性痴呆大鼠的认知功能改善和GAD67、GABABR1的表达的调控作用，证明了BMSCs移植能够通过上调血管性痴呆大鼠海马区域GAD67、GABABR1等GABA能系统中的关键分子来减轻认知功能障碍。为临床BMSCs自体移植治疗血管性痴呆提供了一定理论依据。然而BMSCs在移植之后如何整合入抑制性神经突触中并且促进抑制性神经元的相关分子表达仍未明晰，还有待于进一步探讨。

[1] Iadecola C.The pathobiology of vascular dementia[J].Neuron, 2013,80(4)：844-866.

[2] Soares LM,Schiavon AP,Milani H,et al.Cognitive impairment and persistentanxiety-related responses following bilateral common carotid artery occlusion in mice[J].Behav Brain Res, 2013,249(7)：28-37.

[3] Jiwa NS,Garrard P,Hainsworth AH.Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment：a systematic review[J].J Neurochem,2010,115(4)：814-828.

[4] Xi Y,Wang M,Zhang W,et al.Neuronal damage,central cholinergic dysfunction and oxidative damage correlate with cognitive deficits in rats with chronic cerebral hypoperfusion[J]. Neurobiol Learn Mem,2014,109(3)：7-19.

[5] Mao X,Ji C,Sun C,et al.Topiramate attenuates cerebral ischemia/reperfusion injury in gerbils via activating GABAergic signaling and inhibiting astrogliosis[J].Neurochem Int,2012,60 (1)：39-46.

[6] Cullen PK,Dulka BN,Ortiz S,etal.GABA-mediated presynaptic inhibition is required for precision of long-term memory[J].Learn Mem,2014,21(4)：180-184.

[7] Li CJ,Lu Y,Zhou M,et al.Activation of GABAB receptors ameliorates cognitive impairment via restoring the balance of HCN1/HCN2 surface expression in the hippocampal CA1 area in rats with chronic cerebral hypoperfusion[J].Mol Neurobiol,2014, 50(2)：704-720.

[8] Caputi A,Melzer S,Michael M,et al.The long and short of GABAergic neurons[J].Curr Opin in Neurobiol,2013,23(2)：179-186.

[9] Lu Y,Li C,Zhou M,et al.Clonidine ameliorates cognitive impairment induced by chronic cerebral hypoperfusion via upregulation of the GABABR1 and GAD67 in hippocampal CA1 in rats[J].Pharmacol Biochem Behav,2015,132(1)：96-102.

[10] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989,20(1)：84-91.

[11] Loreth D,Ozmen L,Revel FG,et al.Selective degeneration of septal and hippocampal GABAergic neurons in a mouse model of amyloidosis and tauopathy[J].Neurobiol Dis,2012,47(1)：1-12.

[12] Li G,Bien-Ly N,Andrews-ZwillingY,etal.GABAergic interneuron dysfunction impairs hippocampal neurogenesis in adult apolipoprotein E4 knockin mice[J].Cell Stem Cell,2009,5 (6)：634-645.

[13] Wang J,Fu X,Jiang C,et al.Bone marrow mononuclear cell transplantation promotes therapeutic angiogenesis via upregulation of the VEGF-VEGFR2 signaling pathway in a rat model of vascular dementia[J].Behav Brain Res,2014,265 (5)：171-180.

[14] 樊才瑞,刘卫平,龙乾发,等.骨髓间充质干细胞对血管性痴呆大鼠的保护作用[J].中华神经外科疾病研究杂志,2015(2)：146-149.

[15] 王昌铭,李华信,姚永杰,等.BMSCs颈内动脉移植在VD大鼠脑内存活迁移及其对海马细胞凋亡的影响[J].免疫学杂志, 2014(3)：215-219.

[16] 井沆,田茂,董艳军,等.骨髓间充质干细胞移植对血管性痴呆大鼠认知功能及一氧化氮合酶的表达的影响[J].临床神经病学杂志,2015(4)：276-280.

[17] TaguchiA.Cell-based therapy forpatientswith vascular dementia[J].Psychogeriatrics,2011,11(2)：113-115.

[18] Long Q,Qiu B,Wang K,et al.Genetically engineered bone marrow mesenchymal stem cells improve functional outcome in a rat model of epilepsy[J].Brain Res,2013,1532(3)：1-13.

[19] Wang K,Long Q,Jia C,et al.Over-expression of Mash1 improves the GABAergic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro[J].Brain Res Bull,2013,99(10)：84-94.

[20] Mauri M,Lentini D,Gravati M,et al.Mesenchymal stem cells enhance GABAergic transmission in co-cultured hippocampal neurons[J].Mol Cell Neurosci,2012,49(4)：395-405.

The effect of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on the cognitive ability in arat model of vascular dementia

Hei Yue1,Fan Cairui2,Long Qianfa3,Luo Qiang3,Wei Lizhou1,Yi Xicai1,Liu Weiping1.1Department of Neurosurgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University, Xi’an 710032,China;2Department of Neurosurgery,187th Hospital of PLA,Haikou 571100，China; 3 Department of Neurosurgery,Xi’an central hospital,Xi’an Jiao Tong University,Xi’an 710003,China Corresponding author:Liu Weiping,Email:liuwp@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) transplantation on bilateral common carotid artery occlusion (2VO)-induced cognitive impairments and expression of GAD67 and GABABR1 in the hippocampal CA1 subfield.Methods 60 adult male SD rats were randomly divided into Sham group(n=20),group(n=20)and BMSCs group(n=20).BMSCs transplantation was performed 2 h after the surgery of 2VO.After 28 days,Morris Water Maze(MWM) test was performed to investigate the cognitive changes,and Western blot and immunohistochemistry were used to evaluate the expression of GAD67 and GABABR1 in the hippocampal CA1 subfield.Results(1)Western blot and immunohistochemistry showed that compared to sham group,the expression of GAD67 and GABABR1 (protein level and the intensity of immunohistochemical staining) lowered(1.347±0.357 vs.2.237±0.956，t=5.478，P=0.0076；0.779±0.181 vs.1.691±0.337，t= 4.893，P=0.0073,respectively).(2)while BMSCs transplants partly reversed these changes(1.611± 1.007 vs.1.347±0.357，t=2.379，P=0.0373；1.009±0.257 vs.0.779±0.181，t=2.678，P=0.0441, respectively). (3)MWM also showed thatcognitive ability in the BMSCs group improved significantly(20.817±2.891 vs.30.192±3.472，t=2.743，P=0.0442)compared to VaD group.Conclusion BMSCs transplantation could improve the expression of GAD67 and GABABR1 in the hippocampal CA1 subfield and restore the cognitive ability in a rat model of vascular dementia.

Bone marrow mesenchymal stem cells;Vascular dementia; Cell transplantation; GAD67;GABABR1

2015-05-11)

(本文编辑：张丽)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.05.007

陕西省科技统筹基金资助项目（2013KTCL03-08）

710032西安，第四军医大学西京医院神经外科1；571100海口，解放军第187医院神经外科2；710003西安，西安市中心医院神经外科3

刘卫平，Email：liuwp@fmmu.edu.cn

黑悦,樊才瑞,龙乾发,等.骨髓间充质干细胞移植对血管性痴呆大鼠认知功能的影响[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志, 2015,1(5)：281-285.