纺织品抗菌性能测试中试验菌活性确定的研究

蒋洁蓉, 杨 瑶, 王田田, 黄 璐, 黄启英

(1.江苏省纺织产品质量监督检验研究院， 南京 210007; 2.南京师范大学 金陵女子学院， 南京 210027)

纺织品抗菌性能测试中试验菌活性确定的研究

蒋洁蓉1, 杨 瑶2, 王田田1, 黄 璐2, 黄启英1

(1.江苏省纺织产品质量监督检验研究院， 南京 210007; 2.南京师范大学 金陵女子学院， 南京 210027)

研究了对定时扩增培养后菌液OD600值与纺织品抗菌性能测试中试验菌活性确定相关性，有效地缩减了织物抗菌性能振荡测试法中试验有效性判定所需的试验周期。研究中确定了以扩增培养3.5 h后的试验菌OD600值作为纺织品抗菌性能测试中试验菌活性的评判指标；结果显示OD600值大于0.6的菌液制备接种菌液，标准空白试验菌增长值F≥1.0，即后续抗菌性能测试试验有效；当OD600值在0.6～0.8时，OD600值越大，F值越大，即后续抗菌性能测试试验结果越准确。

纺织品; 抗菌性能; OD600值; 菌种活性; 试验有效性

抗菌纺织品能抑制微生物生长，使织物具有抗菌防臭效果。近年来，抗菌产业发展迅速，各种抗菌产品也纷纷面市[1]。但在中国，纺织品抗菌检测项目较其他传统的纺织品检测项目而言，开展的时间短，检测的机构少，且各单位对各项标准的理解存在分歧。同时，由于微生物的培养[2]、实验人员的操作、标准判定的基准[3-4]也存在异动因素。因此，目前国内检测机构间及各检测机构内不同实验人员间检测结果不一致，在一定程度上制约了抗菌纺织品产业的发展。在各抗菌纺织品的性能检测方法中广为采用的是振荡法，该方法是动态测试法，测试原理是抗菌试样与菌液振荡反应，检测样品与菌液接触前后的抗菌性。该检测方法对试样的形状和吸水性要求都不高，且对于粉末状、液体状、羽绒羽毛及不规则形状织物等都能使用。因此，本文选取振荡法进行研究，通过确立试验菌株的培养条件这一关键环节，为进一步建立振荡法检测抗菌纺织品的标准化实验流程奠定基础。

1 试 验

1.1 材料与仪器

材料：革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌ATCC 6538、革兰氏阴性菌为大肠杆菌ATCC 25922(江苏省博达生物卫生技术有限公司)，营养肉汤、营养琼脂(北京陆桥技术有限责任公司)，磷酸二氢钾、磷酸氢二钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，纯平纹棉标准贴衬织物(平方米质量为(105±5)g/m2，上海市纺织工业技术监督所)。

仪器：YJ-875净化工作台(苏州工业园区三兴净化科技有限公司)、SX-500高压灭菌锅(日本TOMY公司)、FED400烘箱(德国宾德公司)、LRH-250生化培养箱(上海一恒科技有限公司)、THZ-C恒温振荡培养箱(太仓实验设备厂)、6132核酸蛋白测定仪(Eppendorf公司)、Galaxy230菌落计数器(台湾ROCKER)。

1.2 方 法

1.2.1 试剂配制

按照FZ/T 73023—2006《抗菌针织品》中相关条款配制下列试剂。

营养肉汤的配制：牛肉浸膏，3 g；蛋白胨，5 g；氯化钾，5 g；去离子水(最终定容)1000 mL。灭菌后pH值为6.8±0.2。

营养琼脂培的配制：牛肉浸膏，3 g；蛋白胨，5 g；氯化钾，5 g；琼脂粉，15 g；去离子水(最终定容)1 000 mL。灭菌后pH值为6.8±0.2。

0.03 mol/L PBS(磷酸盐)缓冲液的配制：磷酸氢二钠，2.84 g；磷酸二氢钾，1.26 g；去离子水(最终定容)1 000 mL。灭菌后pH值为7.2～7.4，温度4～10 ℃保存备用。

1.2.2 标准空白样的制备

准备符合GB/T 7568.2—2008《纺织品 色牢度 试验标准贴衬织物 第2部分：棉和粘胶纤维》要求的棉标准贴衬织物，至于沸水中高温蒸煮30～40 min，浴比1︰100，室温下用大量蒸馏水洗涤2次，每次5～10 min。在通风处自然悬挂晾干，制成5 mm×5 mm大小的碎片，称取(0.75±0.05) g作为一份试样，用小纸片包好。121 ℃，103 kPa灭菌15 min，备用[5]。经处理的棉织物不含杂质、无油污且具有良好的外观吸水性。

1.2.3 菌种活化与扩培菌液OD600值测定

活化：菌种用甘油冻存[6]。按照FZ/T 73023—2006《抗菌针织品》中相关条款进行菌种活化。甘油冻存菌种转种于营养肉汤于37 ℃培养18～24 h；划转平板培养24～48 h(在冰箱中保存不超过5 d)；取营养肉汤20 mL放入100 mL三角瓶中，用接种环从已培养的平皿中挑取单个菌落接种于营养肉汤培养基中，(37±1)℃，130 r/min，振荡培养(18±1) h。菌液浓度达到1×109～5×109CFU/mL。

扩培菌液OD600值的测定：按照1︰100的比例[7]，取上述活化菌液30 μL于30 mL营养肉汤培养基中，37 ℃，180 r/min，振荡培养。分别于培养的0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h时取菌液用比浊法测定菌液浓度OD 600值，记录数值，精确到0.01。每个时间点重复测定4次。同时，取不同时间间隔菌液经PBS缓冲液适当稀释后涂布，(37±1)℃培养24～48 h，计数。

1.2.4 接种菌液的准备

大肠杆菌接种液：取经3.5 h扩培后OD600值大于0.6的大肠杆菌菌液1 mL用PBS缓冲液进行3×10倍稀释，充分混匀。

1.2.5 试验有效性测试

“0”接触时活菌数：在装有70 mL PBS缓冲液的3个250 mL的锥形瓶中各加入备用标准空白试样(0.75±0.05)g，然后各加入接种菌液5 mL。盖上瓶盖室温振荡1 min后，3个锥形瓶各取混匀的试液1 mL，经2、3次10倍稀释后各取1 mL于营养琼脂培养基上涂布，每个稀释度制作两个平板作为平行样。倒置平板，(37±1)℃培养24～48 h，计数[5]。此为“0”接触时活菌数。

接触18 h后活菌数：经“0”接触取样后的标准空白试样锥形瓶进行封口后，24 ℃，150 r/min，振荡18 h。振荡培养结束后，3个锥形瓶各取混匀的试液1 mL，经3、4次10倍稀释后各取1 mL于营养琼脂培养基上涂布，每个稀释度制作两个平板作为平行样。倒置平板，(37±1)℃培养24～48 h，计数[5]。此为接触18 h后活菌数。

选择菌落数在(30～300)CFU的合适稀释度的平板计数。若最小稀释倍数平板中的菌落<30，则按实际数量记录；若无菌落生长，则菌落数记为“<1”。两个平行平板的菌落数相差应在15%以内，否则此数据无效，应重作试验。

通过标准空白试样细菌增长值(F)的计算判定试验的有效性，即F≥1.0，试验菌活性较强，试验有效[5]。

F=lgWt-lgW0，其中Wt是试验菌与标准空白试样经18 h接触后，3个锥形瓶中试验菌活菌浓度的平均值(CFU/mL)，W0是试验菌与标准空白试样“0”接触后，3个锥形瓶中试验菌活菌浓度的平均值(CFU/mL)。

实践证明，国家的大政方针政策，在基层的贯彻落实是至关重要的。我们作为文化工作者，有责任有义务，把党和国家的文化惠民政策，贯彻落实到广大人民群众中去。我们作为文化工作者，奋斗在一线，就要用我们的智慧和汗水，把文化这块阵地守护好，培植好，浇灌好百花园中的每一朵健康美丽的花朵，为广大人民群众提供精神的芬芳，让每个人都能够享受到改革开放给我们带来的物质和精神成果。

2 结果与讨论

2.1 菌种生长曲线与菌活性确定

大肠杆菌生长曲线：大肠杆菌(E.coli)扩培OD600值测试记录结果见表1。以扩培时间为横坐标、4次重复试验所得平均OD600值为纵坐标作该试验条件下E.coli的生长曲线，结果见图1。如图1(a)所示，经扩增培养3.5 h后，E.coliOD600值达到0.6左右，处于生长对数期[7]。

图1 E.coli和S.aureus扩培生长曲线Fig.1 The growth curves of E.coli or S.aureus after multiplication culture

表1 扩培时间与大肠杆菌OD600值

金黄色葡萄球菌生长曲线：金黄色葡萄球菌(S.aureus)扩培OD600值测试记录结果见表2。以扩培时间为横坐标、4次重复试验所得OD600值的平均值为纵坐标作该试验条件下S.aureus的生长曲线，结果见图1。如图1(b)所示，经扩增培养3.0 h后，S.aureusOD600达到0.6左右。

表2 扩培与金黄色葡萄球菌OD600值

该试验条件下所得扩增培养生长曲线显示，E.coli和S.aureu经过3.0～3.5 h扩增培养后，试验菌OD600值达到0.6左右，细菌进入对数期生长期。此时，细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。生长速率常数最大，即代时最短；细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致；代谢最旺盛。有相关文献报道抗生素作用对该时期的细菌效果最佳[7-8]。因此，该试验条件下，以扩增培养3.0～3.5 h后试验菌OD600值的大小作为细菌生长是否进入对数期判定的依据，从而确保接种液中的细菌细胞处于细胞对数期，统一细胞生理状态，由此减小不同试验中不同批次的试验菌生理状态差异，即活性差异带来的测试结果的不稳定性和不可比性。此外，以扩增培养3.0～3.5 h后的试验菌OD600值初步确认试验菌细胞的活性。即，在该试验条件下，经扩增培养3.5 h后，试验菌OD600值小于0.5，则表明试验菌活性不够，需重新活化试验菌。从而缩减进一步通过有效性判定试验确定试验菌活性的试验时间。

同时，平板计数结果显示经3～3.5 h扩增培养后1 mL试验菌菌液中的活菌数达到108CFU，E.coli和S.aureu经过3.0 h扩增培养后，菌液单位活菌数分别达到1.5×108、1.3×108CFU/mL。经3次稀释后即可达到接种液菌液浓度要求，即105CFU/mL。

2.2 试验有效性判定

取上述3.5 h扩增培养后OD600值达到0.6以上的菌液制备接种菌液进行试验有效性判定测试。多次重复试验结果表明，该条件下的E.coli和S.aureus标准空白试验菌增长值F≥1.0，试验有效，见图2。此外，在0.6～0.8，OD600值与增长值F存在一定的正相关，即OD600值越大，F值越大。由图2(a)(b)比较可知，18 h培养后，S.aureus的试验菌增长值较E.coli略小。分析原因:优化条件下S.aureus的代时通常为27～30 min，而E.coli的代时通常为17 min[9]。但两种测试用菌都能满足试验有效性判定的要求，即试验菌增长值F≥1.0。由此也验证了较E.coli，在S.aureus试验接种菌的准备中应适当地增加营养肉汤量和接菌数量[5]，即不同于E.coli的3次PBS缓冲液10倍稀释，S.aureus采用先2次营养肉汤10倍稀释然后1次PBS缓冲液10倍稀释，且稀释后的接菌液中活菌数目确保在标准要求3×105～4×105CFU/mL的上限，由此可有效实现试验菌增长值F≥1.0，确保试验的有效性。

图2 扩增菌液OD600值与试验菌活性值Fig.2 The correlation between OD600 value of multiplication culture solution and activity value of test bacteria

3 结 论

本文对纺织品抗菌性能测试中试验菌种活性确定进行了探讨性研究。试验结果表明，在标准规定的二步预培养后，试验菌通过3.5 h左右的扩增培养，可使试验菌处于生长的对数期。以此时的试验菌作为接种菌，通过OD600值初步判定试验菌的活性，从而有效确保后期试验的有效性和测试结果的精确度。同时，研究表明经扩增培养后OD600值在0.6～0.8的细菌，后期标准空白试验菌增长值F≥1.0，满足试验有效性判定。同时，标准空白试验增长值F与OD600值存在一定的相关性，即OD600值越大，F值越大。

研究表明试验菌活性的确定是抗菌检测方法中的关键步骤，试验菌活性的一致性是试验结果具有可比性和重演性的基础，高效、准确的活性确定步骤是试验结果快速、准确的关键保障。进一步深入、全面的探讨和研究将最终实现抗菌测试技术达到与中国抗菌纺织品产业发展相称的程度。

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《丝绸》参考文献撰写规范

来稿涉及的参考文献需提供中英文对照，请按GB/T 7714-2005《文后参考文献著录规则》标准著录，并在正文中标出相应序号，举例如下：

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Study on Determining Activity of Bacterial Cells During Testing Antibacterial Property of Textiles

JIANG Jierong1, YANG Yao2, WANG Tiantian1, HUANG Lu2, HUANG Qiying1

(1.Jiangsu Textiles Quality Services Inspection Testing Institute, Nanjing 210007, China; 2.Ginling College of Nanjing Normal University, Nanjing 210027, China)

In order to shorten the test cycle used to determine test effectiveness of antibacterial property vibration test of fabrics, this paper discusses the relationship between the OD600 value of bacterium solution after timed multiplication culture and determination of test bacteria activity in antibacterial property test of fabrics. The research confirms the OD600 value of test bacteria after multiplication culture for 3.5 h as the index to evaluate the test bacterium activity in antibacterial property test. The results show that when the bacterium solution with OD600 value greater than 0.6 is used to prepare inoculant liquid, the growth value of standard blank test bacteriaF≥1.0, i.e. follow-up antibacterial property test experiment is effective; when OD600 value is between 0.6 and 0.8, greater OD600 value means largerFvalue; in other words, the results of follow-up antibacterial property test is more accurate.

textiles; antibacterial property; OD600 value; bacterial activity; test effectiveness

2014-06-16;

2014-12-01

江苏省质量技术监督局科技项目(KJ112514)

蒋洁蓉(1978-)，女，博士，高级工程师，主要从事纺织品安全性和功能性检测研究。通信作者：黄启英，高级工程师，huangqiying_09@163.com。

doi.org/10.3969/j.issn.1001-7003.2015.03.006

TS195.5

A

1001-7003(2015)03-0026-05 引用页码: 031106