吲哚类非甾体抗炎药微生物限度检查法的建立

兰 毅

·实验研究·

吲哚类非甾体抗炎药微生物限度检查法的建立

兰 毅

目的 建立吲哚类非甾体抗炎药微生物限度检查法。方法 按欧洲药典EP8th版, 对吲哚美辛胶囊微生物限度检查方法学进行建立和验证实验。结果 吲哚美辛胶囊对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有很强的抑制作用, 本实验方法消除了其抑菌性对微生物限度检查的影响。结论 该方法适用于非甾体抗炎药吲哚美辛胶囊的微生物限度检查, 且可靠、便于操作。

非甾体抗炎药；吲哚美辛；微生物限度检查；验证

非甾体抗炎药（NSAIDS）主要是一大类具有抗炎、止痛和解热作用的非类固醇药物, 常用于治疗慢性炎症［1］。它可以减轻或控制由炎症引起的如痛经、急慢性附件炎、盆腔炎所致的腰腹部疼痛、术后疼痛［2］、关节或软组织的疼痛等症状。临床上NSAIDS广泛用于骨关节炎、类风湿关节炎和多种免疫功能紊乱炎症性疾病及各种疼痛症状的缓解和肿瘤止痛的阶梯治疗［3］。这类药物在检查微生物限度时, 常发现有抑菌作用, 为保证检验结果的真实性、有效性, 需要消除其抑菌性。作者以吲哚类非甾体抗炎药：吲哚美辛胶囊为例,按照欧洲药典EP8th版微生物限度检查法对其进行总需氧菌和霉菌酵母菌计数方法的建立和验证, 以便为非甾体抗炎药物微生物限度检查方法提供科学依据。目前尚未见有关该产品微生物限度检查方法的报道。

1 材料与方法

1.1 仪器 高压灭菌锅（FOB3-TS）, 生物安全柜（081297802 B）, 培养箱（FRIOCELL 111）, 电热恒温水槽（DKI-2）, 千分之一精密天平（PB303-S/FAC）。

1.2 菌种 金黄色葡萄球菌［ATCC6538］, 铜绿假单胞杆菌［ATCC9027］, 枯草芽孢杆菌［ATCC6633］, 白色念珠菌［ATCC10231］, 巴西曲霉［ATCC16404］均由Microbiologics提供, 具有ATCC官方授权。

1.3 培养基 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）, 沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）, 均由Becton, Dickinson and Company提供。所用试剂均为分析纯。

1.4 样品 吲哚美辛胶囊50 mg （批号：201402001、201402002、201402003）。

1.5 方法

1.5.1 菌液的制备 按欧洲药典EP8th版方法进行菌液制备。菌液制备后若在室温下放置, 应在2 h内使用；若保存在2～8℃, 可在24 h内使用［4］。

1.5.2 供试品的制备 取吲哚美辛胶囊10 g, 加pH=7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至100 ml, 45℃水浴振摇使分散均匀［5］, 作为1：10的供试液, 备用。

1.5.3 稀释液和冲洗液的制备 配制pH=7.0氯化钠蛋白胨缓冲液和pH=7.2磷酸盐缓冲液, 121℃, 15 min高压蒸汽灭菌。取pH=7.0氯化钠蛋白胨缓冲液作为稀释液备用, pH=7.2磷酸盐缓冲液作为冲洗液备用。

1.5.4 总需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法学的建立

1.5.4.1 试验组 ①倾注平皿法：取“1.5.2”供试液1 ml,分别加入0.1 ml菌悬液（≤100 cfu的菌悬液）, 立即注入45℃的溶化的琼脂培养基15～20 ml, 摇匀, 凝固后, 将平板按菌落计数方法测定其菌落数, 作为试验组。②培养基稀释法：A：取“1.5.2”供试液1 ml, 分别加入到2个平皿（0.5 ml/平皿）中, 加入菌悬液0.1 ml/皿, 迅速倒入15～20 ml的琼脂培养基,每个菌株平行制备2组平皿, 待凝；B：取“1.5.2”供试液1 ml分别加人5个平皿（0.2 ml/平皿）, 加入菌悬液0.1 ml/皿, 迅速倒入15～20 ml的琼脂培养基, 每个菌株平行制备2组平皿,待凝。将平板按菌落计数方法测定其菌落数, 作为试验组。③薄膜过滤法：取“1.5.2”供试液1 ml, 加入45℃的pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液使其稀释成200 ml［5］, 混匀, 作为供试液A。分别量取供试液A100 ml, 加入两个无菌滤杯中,经0.45 μm亲水混合纤维素酯滤膜过滤, 每张滤膜使用45℃的pH=7.2无菌磷酸盐缓冲液分为三组进行试验, 每组冲洗液使用量分别为300、400、500 ml冲洗滤膜, 100 ml/次, 真空抽滤, 在最后一次冲洗液中加人菌悬液0.1 ml, 滤干后取出滤膜, 菌面朝上贴于已制备好的相应琼脂平板上, 将平板按菌落计数方法测定其菌落数, 作为试验组。

1.5.4.2 菌液对照组 取试验菌悬液0.1 ml, 按菌落计数方法测定其加入的试验菌菌数。

1.5.4.3 供试品对照组 取“1.5.2”供试液1 ml, 按“1.5.4.1”,不加入任何试验菌悬液, 分别测定不同试验方法下供试品的本底菌数。

1.5.4.4 稀释剂对照组 为考察供试液制备过程中微生物受影响的程度, 用pH=7.0氯化钠蛋白胨缓冲液替代样品按供试液的制备方法制备成空白液, 加入上述5种备用菌液各0.1 ml, 分别测定其菌落数回收率。

1.5.5 回收率测定 各试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值、稀释剂对照组的菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均应在0.5～2.0范围内。

2 结果

2.1 总需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法选择试验结果 倾注平皿法测试总需氧菌计数时, 样品对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌有明显的抑菌作用, 其回收率均≤30%；但同时可以看出在测试霉菌及酵母菌计数时, 各菌种的回收率均在0.5～2.0之间且大约70%, 故对于霉菌酵母菌计数检验可采用倾注平皿法进行后续的方法学验证, 不需再进行筛选。培养基稀释法测试其总需氧菌计数时, 当样品组为0.5 ml/plate, 样品对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌仍存在明显的抑菌作用, 其回收率均≤50%；当样品组为0.2 ml/plate时, 虽然样品对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的抑菌作用有明显的改善, 但实验操作繁琐, 对于皿碟和标准菌株的需求数量要求过多, 仅需氧菌计数试验一个样品组和对照组就需要100个皿碟, 故试验虽然可行但成本过高, 浪费试验和计数时间以及培养箱的空间。薄膜过滤法测试其总需氧菌计数时, 当冲洗液使用量达到300 ml时, 均消除了样品吲哚美辛对五种标准实验菌株的抑菌作用。该实验方法操作简便, 同时也杜绝了培养基稀释法试验中对皿碟和标准菌株需求数量过多的弊端, 且节约试验操作和计数的时间及培养箱的空间, 既可以消除其抑菌活性, 又能经济高效的完成需氧菌的计数故对于吲哚美辛胶囊总需氧菌计数方法可采用薄膜过滤法进行后续的方法学验证。见表1。

2.2 吲哚美辛胶囊微生物计数方法学适用性验证 通过5种标准菌、3次独立平行试验的回收率方法学验证, 吲哚美辛胶囊的微生物限度检查方法为：总需氧菌计数采用“1.5.4.1”试验组方法“③”薄膜过滤法, 冲洗液使用量为300 ml；霉菌酵母菌计数采用“1.5.4.1”试验组方法“①”倾注平皿法进行微生物限度的计数检查。见表2。

表1 总需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法选择试验结果

表2 微生物计数方法学适用性验证

3 讨论

通过对本品的微生物限度检查计数方法的验证, 可采用薄膜过滤法和常规倾注平皿法结合分别对吲哚美辛胶囊总需氧菌, 霉菌菌酵母菌的微生物限度进行检查。可见, 经过实验筛选证明吲哚类非甾体抗炎药物微生物限度检查方法不能全部都采用常规方法（ 倾注平皿法） 进行检查, 必须经过方法验证, 根据验证结果去选择可靠的、准确的并且经济、可操作性高的实验方法, 才能满足未来企业的需求。同时本产品微生物限度方法的建立还为其他具有抑菌成分的非甾体抗炎药物以及近年来国内外研发出现的新剂型吲哚类药物微生物限度检验方法的开发提供了技术理论上的参考。

［1］ 刘艳红, 周小平, 刘荣华.非甾体抗炎药研究进展.江西中医药, 2013（11）:78-80.

［2］ 穆兵.吲哚美辛在妇产科的临床应用.新医学, 2003, 34（3）: 188-192.

［3］ 朱春琴, 崔香玉, 郑桂华.吲哚美辛的临床新用途与不良反应.Herald of Medicine, 2002, 5（21）:112.

［4］ European Pharmacopoeia Commission, European Pharmacopoeia-8th Edition.185-189.

［5］ 孔令春.吲哚美辛的临床应用进展.海峡药学, 2006, 18（2）:116-118.

Establishment of microbial limit test for indoles non-steroidal anti-inflammatory drugs

LAN Yi.
School of Biological Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China

Objective To establish the microbial limit test for indoles non-steroidal anti-inflammatory drugs.Methods According to European Pharmacopoeia 8th Edition, establishment and validation experiment were made for microbial limit test of indometacin capsules.Results Indometacin capsules contained strong inhibiting effect on staphylococcus aureus and bacillus subtilis.This experimental method eliminated the influence of its antibacterial activity on microbial limit test.Conclusion This method is appropriate for microbial limit test of non-steroidal anti-inflammatory drugs as indometacin capsules, and it is reliable and easily operational.

Non-steroidal anti-inflammatory drugs; Indometacin; Microbial limit test; Validation

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.10.190

2015-03-10］

300457 天津科技大学生物工程学院