绿茶汁对面部痤疮抑制的实验观察

李媛媛 , 姜辰阳 ,夏 凡, 王 男,王雨昊,汪 红

(四川大学 生命科学学院，成都 610225)

绿茶汁对面部痤疮抑制的实验观察

李媛媛 , 姜辰阳 ,夏 凡, 王 男,王雨昊,汪 红

(四川大学 生命科学学院，成都 610225)

痤疮是毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病。表皮葡萄球菌是一种条件致病菌，是痤疮发生的重要因素之一。该实验从面部痤疮中分离出表皮葡萄球菌，观察绿茶汁对其是否具有抑制作用。抑菌圈实验比较绿茶汁对面部痤疮细菌(FA)、大肠杆菌、枯草杆菌以及金色葡萄球菌的抑菌效果，实验结果显示，绿茶汁对FA和金色葡萄球菌的抑制效果最为明显，抑菌圈最清楚。菌种鉴定结果，FA的主要菌为金色葡萄球菌。通过将不同浓度的绿茶汁与FA混合培养24h，做平板计数实验，实验结果显示，绿茶汁对FA的抑制效果随着绿茶汁浓度的增加而增强。实验创新思路来源于生活，实验结果运用于生活，为广大因面部痤疮而烦恼的人们提供了一条新途径。

绿茶汁；茶多酚；痤疮；表皮葡萄球菌

1 创新型实验思路

在这个高节奏、强压力的社会中，人们因为各种各样的原因长面部痤疮，用过大量的祛痘产品和护肤产品却收效甚微，同时，产品中各种化学物品的副作却使肤质越来越差。学习知识的目的就是为了运用知识来造福人类。我们的实验思路来源于生活，并且给人们防治面部痤疮提供一种更加健康、便捷的方法。

本实验所用的材料均是可饮用绿茶，纯天然无副作用，绿茶提取物的主要成分为茶多酚(tea polyphenols,TP)。近年来，大量实验研究证实TP具有抑菌[1]、清除自由基、抗氧化[2]的生物活性，在抗癌[3-5]、降压、降脂[6]、降血糖等方面均有较好的功效。开设“绿茶提取物对面部痤疮抑制的实验观察”实验，学生对微生物中的金色葡萄球菌致病性有了感性认识，并通过平板菌落计数法和双层平板法的实验内容，提高学生的实验技能。由于实验内容新颖、贴近生活和生产实际，能够很好地激发学生的实验兴趣和创新热情。因此，该实验可作为微生物基础实验中的创新型实验，为创新人才提供良好的发展平台。

2 实验仪器与材料

2.1 仪器

BA210型显微镜；LRH-250A型生化培养箱；BS224S型电子天平；LDZX-30KBS型高压灭菌锅；DHG-9240型电热干燥箱；SW-CJ-1F型超净工作台；BCD-301型冰箱。

2.2 器材

玻璃试管；烧杯；培养皿；移液枪(10 μL、50 μL、1 000 μL、5 mL)；酒精灯；锥形瓶。

2.3 菌种

大肠杆菌(escherichia coli)；枯草杆菌(bacillus subtilis)；金色葡萄球菌(golden staph)；面部痤疮细菌(facial acne，FA)。

2.4 培养基与试剂

1)牛肉膏蛋白胨培养基

2)液体培养基

3)无菌生理盐水

2.5 菌悬液的制备

将菌接种在牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，在37oC培养24 h后，吸取1 mL无菌水在大肠杆菌的斜面上，用接种环钩分散乳化菌苔，制备菌悬液备用。

3 实验方法

3.1 痤疮细菌的分离

1)用酒精先将痤疮周围的皮肤进行消毒，再用消毒的解剖针挑取痤疮的脓包细菌，采用划线分离法将其划线培养，如图1(a)所示。经过多次分离纯化得到主要的菌种，如图1(b)所示。

2)将分离的痤疮细菌做简单染色，镜检观察到面部痤疮细菌为球菌，如图1(c)和图1(d)所示。经四川省重点实验室——四川大学微生物与代谢工程实验室鉴定，FA菌种为Staphylococcus epidermidis ATCC 14990(T)表皮葡萄球菌。

3.2 绿茶汁的制备

称取绿茶25 g于纱布袋中，将纱布袋口捆绑好放入500 mL烧杯中，加入250 mL蒸馏水用文火熬制30 min。最后，将绿茶汁浓缩到100 mL，用锥形瓶装好存放于冰箱(4 ℃)备用。

图1 面部痤疮提取物的培养和鉴别

3.3 滤纸片法

1)将已灭菌并冷却至50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌平皿中，水平放置并凝固。

2)用无菌移液枪分别吸取0.2 mL的枯草菌、大肠杆菌、金色葡萄球菌和FA菌(均培养18 h)的菌液加入到上述平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀。

3)用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片(D5 mm)浸入绿茶汁(25 ℃)中浸湿(保证滤纸片所含绿茶汁液量基本一致)，贴在上述平板中。

4)将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于37 ℃培养箱中培养24 h，观察记录抑菌圈的直径大小。

3.4 绿茶汁梯度培养

1)取无菌试管7支，依次编号，每管分别加入液体培养基3 mL和FA菌液0.05 mL。

2)除作对照的0号管外，向6支试管(1～6号)分别加入1.60 mL、0.80 mL、0.40 mL、0.20 mL、0.10 mL、0.05 mL绿茶汁。

3)将7支试管的体积用生理盐水稀释至5 mL，摇匀，放入37 ℃培养箱培养24 h后进行检测。

绿茶汁梯度培养按表1所示数据进行加样。

3.5 平板计数法[7]

分别从培养24 h的7支试管中，各取 1 mL培养液于无菌试管中，用生理盐水稀释成10-1，同样的方法稀释样为10-2、10-3，根据情况确定是否稀释至10-4；将稀释后的样液混合均匀，从中取出1 mL，加入培养皿中；将溶解并冷却至50 ℃左右的平板计数培养基加入到培养皿中，每皿约20 mL；左右交换摇匀，待凝固后置于37oC恒温培养箱中倒置培养24 h，观察并计数每皿菌落数，如图2所示，再根据稀释倍数计算样液中细菌总数，绘制菌落数变化曲线。

表1 绿茶汁梯度培养数据 mL

图2 FA不同浓度平板计数结果

4 实验结果与分析

4.1 滤纸片实验结果

按3.3所述方法实验，观察记录抑菌圈的直径大小并绘制如图3所示的折线图和如图4所示的抑菌圈图。

图3 FA和对比菌抑菌圈直径大小折线图

4.2 浓度梯度实验结果

利用平板技术法对放入茶多酚的细菌培养液中的细菌数量变化进行了检测，绘制的菌落数变化曲线如图5所示。

5 结束语

通过在基础微生物教学实验室开展绿茶提取物对面部痤疮抑制的实验探索，成功观察到绿茶提取液对FA的杀伤作用，并通过测量抑菌圈的直径大小，说明绿茶汁对FA的杀伤作用最强。同时，对不同浓度的绿茶汁和FA的持续混合培养液进行平板计数实验，观察到菌落的存在及其变化，说明不同浓度的绿茶汁对FA的杀伤作用不同。

图4 FA和对比菌的生长情况

图5 FA和绿茶培养液混合培养细菌数的变化

本实验成功地验证了绿茶汁对FA的抑制作用，且用平板计数法很好地找到了适合观察的浓度区间，可为开设基础微生物学实验和环境微生物学实验奠定基础。

基于绿茶汁液对痤疮的显著效果，可以将其投放到护肤品市场，开发天然无副作用的改善痤疮的产品，解决人们对痤疮的烦恼。

[1]王济安.茶汤抑菌作用的实验报告[J].茶报，1998(1)：12-13.

[2]乔凤云，陈欣，余柳青，等.抗氧化因子与天然抗氧化剂研究综述[J].科学通报，2006，22(3)：332-336.

[3]何皎.茶多酚的药理学研究概况[J].数理医药杂志，1999，12(4)：372-374.

[4]Yang G Y，Liao J，Kin K，et al.Inhbition of growth and induction of apoptosis in human cancer cell lines by tea polyphenols[J]. Carcinogenesis，1998,19(4):611-616.

[5]Cameron A R， Anton S， Melville L，et al. Black tea polyphenols mimic insulin/insulin-like growth factor-1 signalling to the longevity factor FOXO1a[J]. Aging Cell，2008，7 (1): 69-77.

[6]Lin C L，Huang H C， Lin J K. Theaflavins attenuate hepatic lipid accumulation through activating AMPK in human HepG2 cells[J]. The Journal of Lipid Research，2007，48 (11): 2334-2343.

[7]沈萍，陈向东.微生物学实验[M].4版.北京：高等教育出版社，2007.

Experimental Observation of Green Tea Extractive on the Inhibition of Staphylococcus Epidermids

LI Yuanyuan, JIANG Chenyang, XIA Fan , WANG Nan, WANG Yuhao, WANG Hong

(College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

Acne is a chronic inflammatory skin disease of the pilosebaceous unit. While the major acne bacteria are Staphylococcus epidermidis. It is an opportunistic pathogen and one of the important factors for the occurrence of acne. In this experiment, we isolated staphylococcus epidermidis from facial acne. Then, we observed whether the green tea extractive have the inhibitory effect of staphylococcus epidermidis. Experiment and compared the green tea extractive effectiveness of against main strains of the extractive of facial acne with Escherichia coli, Bacillus subtilis, Golden staph by using inhibition zone, experimental results show that the inhibitory effect of green tea extractive on staphylococcus gold is most evident. By diluting different concentration gradients of green tea extractives blended with acne extractive make tablet counting experiments, experimental results showed inhibitory effects of extractives of green tea extractive for acne with increasing concentration and enhanced, to some a few bacteria survive after suppression of time. Final strain identification and expectations met that major acne bacteria is staphylococcus gold. Experiment of innovative ideas comes from life, the experimental results used in life, for the majority of people worry about facial acne offers a new way.

green tea extract; green tea polyphenols; acne; staphylococcus- epidermidis

2014-10-17；修改日期: 2015-01-04

四川大学大学生创新实验基金资助项目(2013-2014)。

李媛媛(1993-)，女，本科在读， 专业方向：生物科学。

汪 红(1961-)，女，学士，高级实验师，主要从事微生物学实验教学工作。

R

Adoi:10.3969/j.issn.1672-4550.2015.01.070