基因芯片与液体快速培养技术诊断耐药结核病的对比研究

楚丽香 孙波 姜春梅 闫宇 刘玉琴

基因芯片与液体快速培养技术诊断耐药结核病的对比研究

楚丽香 孙波 姜春梅 闫宇 刘玉琴

目的对比研究基因芯片与液体快速培养技术诊断耐药结核病的效果。方法 1156例疑似肺结核及肺结核患者的同一痰样本, 同时应用基因芯片技术(芯片组)与液体快速培养技术(快培组)进行结核菌耐药检测, 对两组检测结果进行对比分析。结果 对两组实验检测结果进行对比分析, 结核菌检出率：芯片组270例, 阳性率为23.36%, 快培组237例, 阳性率为20.50%。结核菌耐药结果：芯片组46例, 耐药率为17.04%, 快培组43例, 耐药率为18.14%, 比较差异无统计学意义(P＞0.05)。芯片组与快培组同时检出结核菌阳性时, 二者耐药符合率达80%。结论 基因芯片检测结合聚合酶链式反应(PCR)技术和反向杂交技术(RDB)诊断结核病及耐药结核病, 具有简便、快速、灵敏、准确的特点, 及时检出结核病及耐药结核病, 指导临床针对性制定个性化抗结核方案, 避免盲目制定抗结核方案而导致医源性耐药结核病的出现, 真正有效控制结核病及耐药结核病。

结核分枝杆菌；耐药性；基因突变；基因芯片；反向杂交点技术

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 选取2013年5月～ 2014年9月在本院就诊的1156例疑似肺结核或肺结核患者, 用同一痰样本同时做结核分枝杆菌耐药突变基因检测与快速液体培养及药敏检测, 结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒(基因芯片法)由亚能生物技术(深圳)有限公司生产, PCR扩增仪、分子杂交仪均由亚能生物技术(深圳)有限公司提供。

1.2 样本制备 快速液体培养标本参照《结核病诊断实验室检验规程》［1］结核菌培养标本处理方法处理后进行培养和鉴定, 并进行药物敏感性实验。耐药突变基因检测的样本, NaOH消化, 100℃加热10 min, 13000 r/min离心2 min, 上清液即为DNA模板。

1.3 基因芯片检测 采用PCR进行基因扩增, 将PCR扩增产物加入装有基因芯片的杂交管中, 并将混合物加热至100℃变性10 min, 之后迅速放入分子杂交仪中进行杂交反应, 再将完成杂交的芯片进行洗膜、孵育、显色等过程, 最后进行结果判读。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示, 采用t检验；计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 快培组药敏检测结果 在1156例临床痰样本中, 共检出结核分枝杆菌237株, 检出阳性率为20.50%, 药敏实验结果表明其中43株为耐药株, 耐药率为18.14%。

2.2 芯片组检测结果 在1156例临床痰样本中, 使用基因芯片共检出结核分枝杆菌270例, 检出阳性率为23.36%, 其中46例为耐药结果, 耐药率为17.04%。

2.3 基因芯片法与快速液体培养法的结果比较 芯片组与快培组的结核菌阳性检出率和结核耐药率比较, 差异无统计学意义(阳性率χ2=2.751, 耐药率χ2=0.107, P＞0.05), 将两组数据进行临床对比分析得出, 芯片组与快培组同时检出结核菌阳性时, 二者耐药符合率为80%。见表1。

表1 1156例患者的基因芯片检测与快速液体培养阳性率及药敏检测结果比较［n(%)］

3 讨论

传统的结核菌罗氏培养技术需要3个月才能确定耐药结核病, 其阳性率不到10%, 最近几年开展的抗酸分枝杆菌液体快速培养技术, 将检测时限缩短至7～42 d, 但仍需要先做抗酸分枝杆菌培养, 培养出抗酸分枝杆菌后再做药敏检测需要4～15 d, 共计11～57 d, 确定肺结核及耐药结核病时限仍不能令人满意, 且阳性率不超过25%, 临床医生拿不到实验室依据确定耐药结核病, 无法制定个性化抗结核治疗方案, 以往的经验性抗结核方案并不能完全有效控制结核病［1,2］。

目前已知98%以上结核分枝杆菌利福平耐药性与rpoB基因中一长约81bp片段所编码的氨基酸突变有关, 其基本机理为正常情况下利福平通过和由rpoB基因编码的RNA聚合酶β亚基特异性结合, 来阻断结核菌RNA的合成, 导致结核菌的死亡［3,4］。当rpoB基因突变时利福平不能阻断结核菌RNA的合成, 也就不能发挥作用。目前已知结核菌异烟肼耐药性与katG、ahpC、inhA等基因突变有关, 乙胺丁醇和链霉素的耐药相关基因分别是embB、rpsL基因。

本实验所采用的结核分枝杆菌耐药突变基因芯片检测,结合聚合酶链式反应(PCR)技术和反向点杂交(RDB)技术,根据结核分枝杆菌标准株H37Rv序列, 设计了覆盖rpoB、katG、inhA、embB、rpsL等基因突变区的系列寡核甘酸探针,制作膜芯片, 检测标本中结核分枝杆菌基因突变情况, 从而确定结核分枝杆菌(MTB)是否存在对利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇4个抗结核一线药物耐药。

基因芯片技术对结核菌的检出率高于液体快速培养, 二者同时阳性者, 耐药符合率80%, 原因是目前已经确定的结核菌耐药突变基因主要是上述几种, 还有未被发现的基因突变, 或探针之外未能检测到的基因突变, 另外就是痰标本中的结核菌基因突变的位点不完全一致, 目前为止, 还没有发现结核分杆菌耐药突变基因检测结果假阳性者, 基因芯片与结核菌液体快速培养技术及罗氏培养技术可以互补。

基因芯片技术具有快速、灵敏、准确、高通量等特点,因此采用基因芯片法检测结核分枝杆菌及其耐药性, 比现有的快培方法更加符合临床的需要。本检测最大的优势在于检测周期短, 自动化程度高, 能够及时检出结核病及耐药结核病, 指导临床针对性制定个性化抗结核方案, 避免盲目制定抗结核方案而导致医源性耐药结核病的出现, 从而真正有效控制结核病及耐药结核病。

本项研究实验结果表明, 采用基因芯片技术与传统的结核菌液体培养技术比较, 符合率很高。而且只需8 h就能得到结果, 同时获得四种抗结核一线药物的耐药情况, 相较于传统的结核菌液体培养动辄需要2～8周的时间, 大大缩短了药敏检测的时间, 有利于快速指导临床治疗方案。

［1］ 中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程.北京:中国教育文化出版社, 2006:54, 56-57.

［2］ 唐神结, 许绍发, 李亮.耐药结核病学.北京:人民卫生出版社, 2014:96-111.

［3］ 李芳芳, 方红辉, 何林, 等.结核分枝杆菌耐药基因rpoB、katG、inhA突变快速检测方法研究.热带医学杂志, 2005, 5(6): 743-746.

［4］ 单万水, 吴驰, 陈心春, 等.基因芯片技术在结核分枝杆菌耐药突变基因检测中的应用.国际检验医学杂志, 2008, 29(11): 112-114.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.13.128

2014-12-25］

黑龙江省卫生厅科研课题(项目编号：2013318)

157000 黑龙江省牡丹江市传染病医院(楚丽香孙波 姜春梅 闫宇)；黑龙江省结核病防治院(刘玉琴)