幽门螺杆菌毒素相关蛋白A的EPIYA多态性对胃上皮细胞AGS形态及IL-8表达的影响

刘鹿，王艳春，陶好霞，袁盛凌，王令春，刘纯杰

军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071

作为世界第四大癌症，全球每年新发胃癌100余万例，中国占42%；胃癌每年死亡人数约80万，中国占35%。中国是胃癌发病率和死亡率最高的国家之一，发病率和死亡率均2倍于世界平均水平，恶性肿瘤死亡病例中，胃癌位列死亡总数的第二位[1]。

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是一种可长期定植于人类胃黏膜的革兰阴性菌，在世界范围感染率超过50%，是引起胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关的淋巴样组织淋巴瘤和胃腺癌的重要病原体[2-3]。1994年，幽门螺杆菌被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌因子。幽门螺杆菌与胃癌的发展密切相关，其中，幽门螺杆菌毒素相关蛋白A（cytotoxin-associated gene A，CagA）与胃癌的关系已被广泛深入研究[4-6]。

CagA由cagA基因编码，基于C端的谷氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸基序（EPIYA基序）的数量及组合而分类其多态性及分型[7]。EPIYA基序分为A、B、C和D等4类。具有EPIYA-C的CagA属于东亚型CagA，具有EPIYA-D的CagA属于西方型CagA[8]。随着世界人口的流动，目前出现了既不同于东亚型，亦不同于西方型的新型CagA，如美国印第安型（Amerindian）及日本西方型（J-Western），且含新型CagA的菌株范围有日益扩展的趋势[9-10]。许多研究者在体外用CagA（+）的幽门螺杆菌感染胃上皮细胞株AGS，可导致AGS细胞出现以细胞伸长和扩散为特征的独特形态学改变[11]；亦有报道CagA可引起NF-κB激活，使白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）表达增强，从而增加胃腺癌的发生[12]。这可能预示单独CagA可以作为导致胃癌形成的细菌毒力因子。揭示幽门螺杆菌CagA蛋白致病机制，对于阐明胃癌发生机制具有重要意义。

我们通过设计、人工合成并优化不同cagA基因型，构建相应表达载体，转染胃上皮细胞AGS后，观察与分析比较幽门螺杆菌CagA EPIYA多态性对细胞形态及IL-8的影响，为幽门螺杆菌感染致病机制研究、风险评估及根除治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

胃上皮细胞株AGS由本室保存；Fast Pfu DNA聚合酶购自TransGen公司；T4DNA连接酶购自Fer⁃mentas公司；质粒pcDNA3.1（+）购自Invitrogen公司；琼脂糖凝胶PCR产物回收试剂盒购自Promega公司；F12培养基、胎牛血清购自GIBCO公司；细胞裂解液购自Novagen公司；jet PRIME转染试剂盒、OMEGA无内毒素小量质粒提取试剂盒Ⅰ、蛋白酶抑制剂购自Calbiochem公司；CagA抗体、GAPDH抗体HRP酶标山羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司；ECL底物显色试剂盒购自TIANGEN公司；OptEIA人IL-8 ELISA检测试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2 各型cagA基因的优化、合成及质粒的构建与制备

参考幽门螺杆菌 Ca52、NCTC11637、98-10、F75、Shi470及PNGhigh85株的CagA设计其C端序列；采用CUTG（Condon Usage Tabulated from Gen⁃Bank）提供的人密码子使用频率表对各序列在GC含量、二核苷酸频率、密码子偏性、隐蔽剪接位点及ATTTA序列替换等五方面进行分析。由于CagA蛋白N端极为保守，故N端统一采用98-10株CagA的N端。将优化后的序列交公司合成。采用重组克隆试剂盒法，将各型C端分别和98-10株CagA N端与pcDNA3.1载体进行连接，用质粒提取试剂盒进行各型质粒的提取。

1.3 细胞培养及转染

采用F12培养液（含10%胎牛血清），于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养AGS细胞2～3 d，细胞融合达95%左右即可用0.25%胰酶消化，并按1∶3传代培养。转染前1 d，在6孔培养板每孔中接种4×105细胞，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，当融合达80%～90%时，按照转染试剂盒说明进行转染，每孔加入2 μg各型CagA质粒，转染后48 h内进行相关检测。

1.4 CagA表达检测

转染后24 h，在每孔中加300 μL细胞裂解液，冰浴5 min后收集细胞裂解物进行SDS-PAGE，电泳结束后转膜至NC膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，PBST洗膜5 min，一抗37℃结合1 h，PBST洗膜3次（每次5 min），二抗37℃结合1 h，PBST洗膜3次（每次5 min），加ECL发光试剂检测目的蛋白，GAPDH为内参蛋白。

1.5 细胞形态观察

转染后在不同时间点于光学显微镜下观察AGS细胞的形态，并于转染后24和36 h对伸长的蜂鸟状细胞进行计数。不同型进行6次转染，每次转染3孔，每孔随机截取3张镜下图像，蜂鸟状细胞测量与计数采用ImageJ软件，定义细胞形态针状突出＞1.5 μm为蜂鸟状细胞，仅转染空载体的AGS为阴性对照。结果采用Student-Newman-Keulsa（SNK）法进行统计学分析。

1.6 细胞IL-8表达检测

转染后12、36 h分别收集100 μL各型细胞培养上清液，7000 r/min离心10 min，于-80℃储存，

按照OptEIA人IL-8 ELISA检测试剂盒说明进行IL-8表达检测，仅转染空载体的AGS为阴性对照。结果采用SNK法进行统计学分析。

2 结果

2.1 各型cagA基因的优化、合成及质粒的构建与制备

采用重组克隆试剂盒法，对各基因片段进行扩增、回收，将基因片段与载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选并鉴定携带表1所列CagA各型特征重组质粒的重组菌。测序表明序列正确。

2.2 CagA表达检测

将各型质粒转染AGS细胞，用Western印迹检测CagA的表达，采用ImageJ软件对各型CagA与其对应的内参蛋白GAPDH的比值进行定量分析，发现无统计学差异，说明各型CagA在AGS细胞中均得到了表达，表达水平没有明显差异。

2.3 细胞形态观察

转染cagA的AGS细胞可出现以细胞伸长和扩散为特征的独特形态学改变，形似蜂鸟的嘴，被称为“蜂鸟表型”。在转染后不同时间点对AGS细胞进行镜下观察，可发现与空载体相比较，各型CagA均能引起细胞蜂鸟状改变的增加（NCTC11637株cagA转染AGS细胞后各时间点细胞形态见图2A）。对转染后24、36 h的“蜂鸟表型”细胞进行计数，结果表明各亚型CagA均能引起发生蜂鸟状改变的AGS细胞数量增加。与空载体对照相比较，转染后24和36 h，CagA的6种亚型皆有非常显著差异（P＜0.001），CagA ABCCC与其余5种亚型有非常显著差异（P＜0.001），CagA ABDD与 CagA ABC 和 CagA J-West⁃ern有非常显著差异（P＜0.001）；24 h时，CagA ABDD与CagA Amerindian有非常显著差异（P＜0.001）；36 h时，CagA ABD分别与CagA ABC和Ca⁃gA J-Western有非常显著差异（P＜0.01）。

表1 CagA分型及世界分布

图1 Western印迹检测各型CagA的表达A：各型CagA与相应内参蛋白的表达比；B：Western印迹检测转染后空载体及各型CagA的表达；0：pcDNA3.1；1：CagA Amerindian；2：CagA ABD；3：CagA ABC；4：CagA ABDD；5：CagA ABCCC；6：CagA J-Western

2.4 IL-8表达检测

大量实验证明，AGS细胞转染cagA后8～40 h时IL-8处于稳定表达状态，且36 h左右达表达高峰。于转染后12、36 h分别收集100 μL细胞培养上清液，ELISA检测转染各型cagA后细胞的IL-8表达。统计分析表明，转染后12 h，较空载体对照，CagA ABDD存在非常显著差异（P＜0.01）；转染后36 h，较空载体对照，CagA ABD和CagA J-Western存在非常显著差异（P＜0.01），CagA ABDD和CagA ABCCC存在非常显著差异（P＜0.001）；CagA Amerindian与CagA ABD和CagA J-Western分别存在非常显著差异（P＜0.01），与CagA ABDD和CagA ABCCC分别存在非常显著差异（P＜0.001）；CagA ABDD 和 CagA ABCCC分别与CagA ABD、CagA ABC和CagA JWestern存在非常显著差异（P＜0.001）。

图2 幽门螺杆菌NCTC11637株cagA转染AGS细胞后各时间点的细胞形态（A）及转染后各型蜂鸟状细胞占细胞总数的百分比（B）0：pcDNA3.1；1：CagA ABD；2：CagA ABDD；3：CagA ABC；4：CagA ABCCC；5：CagA Amerindian；6：CagA J-Western

图3 AGS细胞转染各型cagA基因后的IL-8表达

3 讨论

胃癌是一种由多因素引起的疾病，目前CagA阳性的幽门螺杆菌感染在胃癌发病机制中起着至关重要的作用。CagA分型具有地域分布特征，其致病能力也随地域的不同而变化。我们构建含不同CagA分型的质粒转染AGS细胞，旨在消除其他因素对实验结果的干扰，同时对各型CagA序列进行优化，使CagA更好地在哺乳动物细胞中得到表达[13-14]。

SHP-2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员，其作为一种多功能信号传导蛋白，与细胞生命活动如细胞增殖、分化、移动、死亡的调控密切相关[15-17]。有报道称东亚型CagA与SHP-2的结合能力更强，更能产生强烈的细胞形态改变[18]。此外，含多个EPIYA-C的西方CagA亦拥有更强的与SHP-2结合的能力[19]。细胞是一切生命活动的基础，有报道显示细胞蜂鸟状形态的改变可引起细胞紧密连接的破坏，从而与胃病严重程度相关[6,20]。本实验中，CagA的存在大量增加了AGS蜂鸟状细胞的比例，西方型中，蜂鸟状细胞的形成与EPIYA-C的数量呈正相关；东亚型中，未发现蜂鸟状细胞的形成与EPIYA-D数量的关系。东亚型较西方型产生了更多蜂鸟状细胞，但二者间比较不具有统计学差异。目前尚无证据证明CagA与SHP-2相关引起胃癌的机制，但值得探讨的是，CagA所诱导的蜂鸟状细胞改变很可能与胃黏膜组织的癌变密切相关。

IL-8是趋化因子家族的细胞因子，在炎症形成时可引起中性粒细胞趋化和脱颗粒，引发黏膜局部炎症，导致胃局部炎症-胃癌的发生和发展[21]。有研究显示，CagA阳性的幽门螺杆菌诱导分泌的IL-8水平高于CagA阴性的菌株[22]。大量实验研究了西方型CagA各型与胃病的关系，鲜有研究进行东亚型CagA与西方型CagA的对比。本实验中，CagA的存在增加了IL-8的分泌，IL-8的分泌表达同EPIYA-C和EPIYA-D基序的个数呈正相关。

随着世界人口的流动，目前出现不同于基本分类东亚型和西方型的新型CagA，如在美国出现的CagA Amerindian和在日本冲绳出现的CagA JWestern。本实验中，CagA Amerindian、CagA JWestern分别与空载体、东亚型及西方型间的差异具有统计学意义，这也暗示CagA Amerindian、CagA JWestern与东亚型及西方型间不仅仅是序列的差异，更有可能是由序列的差异引起了宿主细胞功能的差异。有报道称CagA Amerindian与轻度胃炎性疾病相关，而与胃癌关系不大[9,23]，这也与本实验中CagA Amerindian所致IL-8表达量相对较低相呼应。

综上所述，幽门螺杆菌CagA蛋白可引起胃上皮AGS细胞蜂鸟状改变及IL-8表达增加，其可变区EPIYA基序C数目的增加与细胞蜂鸟状改变呈正相关，EPIYA基序C和D数目的增加与IL-8表达呈正相关。

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