STR试剂盒在快速数据库建设中的应用

刘亚举，张俊涛，金海英



·法医学·

STR试剂盒在快速数据库建设中的应用

Application of Direct and Rapid PCR Amplification Kit of STR in DNA Database

刘亚举1，张俊涛2，金海英3

目的 评价STRtyper-21G Plus试剂盒在DNA数据库建设中的应用。方法 针对各种纸质血样本特性，优化扩增体系和引物量、样本的取样量及循环次数，缩短PCR扩增时间，以建立适合批量样本直接快速扩增检验的方法，将其应用于2 000份数据库样本的检验中，并与PowerPlex®21试剂盒进行比较。结果 采用10 μL扩增体系时，得到了STRtyper-21G Plus试剂盒批量样本检验的最适取样量和扩增循环次数，建立了快速扩增反应程序，2 000份样本的直接快速扩增检验成功率为98.7%，批量检验92份样本(1个96孔板) 从取样到电泳结束只需5 h；PowerPlex®21试剂盒分别为98.1%和6 h。结论 STRtyper-21G Plus试剂盒的应用，省去样本DNA提取过程，操作方法简单、快速，获得信息量大，适用于DNA数据库建设的需要。

法医物证学；直接快速扩增法；STRtyper-21G Plus试剂盒；DNA数据库

在众多STR基因座中，以突变率低、多态性较好、易于标准化等优点的基因座在法医DNA分析中被优先采用，其中遗传多态性要满足DP>0.9、H>0.7[1]。作者对河南汉族50余个STR基因座遗传多态性进行了调查[2-4]，在衔接法庭科学DNA数据库发展的基础上，筛选了适合DNA数据库建设应用的STR基因座。本文主要探讨这些STR基因座所建立的直接复合扩增体系在快速数据库建设中的应用。

1 材料与方法

1.1 样本 本实验室建库血样2 000份。其中FTA卡样本500份、普通滤纸样本500份、公安部物证鉴定中心研制的采集卡样本500份、武汉骥腾公司研制的采集卡样本500份。

1.2 主要试剂与仪器 BSD-QP型打孔机(BSD公司，澳大利亚)；Hamilton STAR-LET自动化工作站(AusBio公司，瑞士)；9700型PCR扩增仪和3500XL型遗传分析仪、ID-X分析软件(AB公司，美国)；GeneMarker®HID分析软件(SoftGenetics公司，美国)；IDproof分析软件(Qiagen公司，德国)。STRtyper-21G Plus试剂盒(宁波海尔施基因科技有限公司)和PowerPlex®21试剂盒(Promega公司，美国)。

1.3 优化PCR扩增条件 扩增体系和引物量：采用5、10、25 μL扩增体系和2×、4×、10×引物量对1 ng 9947A标准品分别进行检验并重复1次。不同纸质载体的取样量及循环次数：随机抽取FTA血卡、血滤纸、公安血液采集卡、武汉血液采集卡样本各100份，各样本按直径0.5 mm和1.0 mm分别取样。采用10 μL PCR反应体系，其中Master Mix(包含TritonX-100、Mg2+、dNTP、Betaine、Tween20和HS-Taq聚合酶)5.0 μL，Primer Set 2.5 μL，纯水2.5 μL。PCR反应程序为：95℃ 10 min；94℃ 20 s，61℃ 1 min，70℃ 1 min；60℃ 30 min；4℃保温；循环次数设置为24、26、28、30、32 次。快速扩增体系及程序：优化Master Mix配制，按照上述体系用量配比PCR反应液，同时改变变性、退火、延伸时间，PCR扩增反应程序见表1。

表1 快速PCR扩增反应程序

1.4 批量样本的取样与快速扩增 2 000份样本，按照前述方法取样，96孔板样品孔中待测样本92份，设置阴性和阳性，H6、F12孔空置( 用于电泳时加Ladder)，按照表1程序进行PCR扩增。2 000份样本，按照PowerPlex®21试剂盒说明书打取血样和进行PCR扩增。

1.5 电泳检测与分型分析 取1.0 μL上述PCR扩增产物与0.5 μL内标和8.5 μL去离子甲酰胺混合；H6和F12孔内加入Ladder 1.0 μL。置3500XL型遗传分析仪上全自动毛细管电泳，结果用GeneMarker®HID或IDproof分析软件进行等位基因分型，并采用GeneMapperID-X分析软件复核分析。全部基因座检出STR分型界定为成功。

2 结果

2.1 方法验证结果

2.1.1 扩增体系 应用不同体系进行扩增，分型结果一致，未出现等位基因丢失和非特异峰等情况，部分基因座出现的stutter峰均在主峰的10%以下，空白对照样本正常。随着扩增体积减小，峰值(rfu) 有增强的趋势，5 μL体系在2 000～20 000之间，10 μL体系在2 500～10 000之间；25 μL体系在700～6 000之间(图1)。比较显示，在标准体系(10 μL)下，获得的图谱均衡性最好。

图1 不同扩增体系检测结果

图2 不同引物量检测结果

2.1.2 引物量 应用不同引物量进行扩增，分型结果一致，未出现等位基因丢失的现象。峰值(rfu)范围，2×引物量在200～3 000之间，4×引物用量在600～10 000之间，10×引物用量在1 0000～3 0000之间。分型图谱均未出现非特异峰，部分基因座出现的stutter峰均在主峰的10%以下(图2)。比较显示，4×引物量条件下，平均峰值最高。

2.2 PCR扩增条件优化后的结果

2.2.1 取样量 FTA血卡取样直径为1.0 mm时，出现大片段丢失等情况，获得完整分型的成功率较低；取样直径为0.5 mm时，检出(全部基因型)成功率为98.2%。血滤纸、公安血液采集卡和武汉血液采集卡取样直径为1.0 mm时，检出(全部基因型)成功率为99.6%；取样直径为0.5 mm时，大部分样本出现等位基因丢失现象。因此，使用10 μL扩增体系时，FTA血卡取样直径应为0.5 mm，而血滤纸、公安血液采集卡和武汉血液采集卡取样直径应为1.0 mm。

2.2.2 循环次数 随扩增循环次数的递增，荧光检测信号逐渐增强。循环24、26次，荧光信号检测均值较低，部分基因座在100 rfu以下，且部分基因座扩增不完全；循环28、30、32次，扩增均得到分型一致的结果，未出现等位基因丢失的情况，峰值(rfu)分别为700～5 000、1 000～12 000、3 000～30 000，部分基因座出现的stutter峰均在主峰的10% 以下(图3) 。由于循环30次以上时产物量较大，容易产生渗透峰，最终确定样本质量较好时，采用27或28次循环，样本质量较差时，可增加循环参数至29或30 次。

图3 不同循环次数检测结果

2.2.3 快速扩增检验 应用快速扩增反应获得的STR分型结果，峰值(rfu)均值在800～10 000之间，各基因座扩增结果均衡性较好，无明显非特异性扩增(图4)。两步法和三步法快速扩增反应，循环29次其峰值(rfu)均值在1 000～20 000之间(图5)。

图4 快速扩增反应程序建立前后的电泳图谱

图5 快速扩增反应程序两步法和三步法的电泳图谱

2.3 批量样本检验结果 使用STRtyper-21G Plus试剂盒，采用本文优化方法进行快速扩增反应，结果均获得了良好的分型结果，并与PowerPlex®21试剂盒分型一致，其一次检出成功率为98.7%，批量检验92份样本(1个96孔板) 从取样到电泳结束只需5 h；而PowerPlex®21试剂盒分别为98.1%和6 h。由于allelic ladder以外的等位基因都必须进行人工识别，表2为两个试剂盒基因座allelic ladder及bin的数量。STRtyper-21G Plus试剂盒在有些基因座会标注为off-ladder(OL)，而PowerPlex®21试剂盒自动标注等位基因(图6)。

表2 两个试剂盒allelic ladder及bin数量

图6 D21S11基因座在两个试剂盒中的标注

3 讨论

STRtyper-21G Plus试剂盒和PowerPlex®21试剂盒一样，包含21个基因座(20个STR基因座和1个Amelogenin性别基因)，20个STR基因座[2-3]累积个体识别率(CDP)为1-7.6841×10-25，二联体累积非父排除率(CPEduo)为1-4.2719×10-6，三联体累积非父排除率(CPEtrio)为1～2.1079×10-9，与GlobalFiler试剂盒全部21个STR基因座的遗传学参数相当[3]，满足法医DNA检验要求。同时，STRtyper-21G Plus试剂盒可直接扩增各种纸质载体样本，不仅省去DNA提取环节，而且可以有效防止污染，使操作更为简单。可直接扩增检验与以下因素有关：①Buffer中包含的TritonX-100等细胞裂解剂成分，能够起到裂解细胞释放DNA 的作用[5-7]；②反应缓冲液中加入了Betaine、Tween20等PCR增强剂，可以抵抗血色素等的抑制作用[6-7]；③特效的HS-Taq聚合酶对血红素、腐殖酸等抑制物的耐受性更强。

采用直接扩增方法，取样直径和PCR循环次数等主观因素对检测结果影响较大。本文结果显示，在成功STR分型的前提下，应尽量减少取样量和循环次数，以减少体系中PCR抑制物的含量和降低高浓度产物所产生的渗透峰对判型的影响。对于FTA卡等纸质较厚的采血卡，选择0.5 mm和27/28次循环；对于较薄的采血卡，则选择1.0 mm和27/28 次循环为宜；如果样本质量较差或保存时间较长，可适当增加取样量和循环次数(29/30次)。为了达到快速检验，本文通过优化程序使PCR反应时间为70 min(两步法)和90 min(三步法)，在同等取样直径和PCR循环次数的情况下，两步法和三步法的检验结果无差别，批量检验92份样本(1个96孔板) 的时间在5 h内(取样30 min、PCR扩增70～90 min、电泳160 min、其他20 min)，满足DNA数据库大规模样本快速检测的要求。

STRtyper-21G Plus与PowerPlex®21试剂盒包含的21个基因座一样，但PowerPlex®21试剂盒的allelic ladder优于STRtyper-21G Plus。而Bin是通过分析同一个基因座在人群中所有等位基因的片段大小，输入标准数据并由软件生成类似于allelic ladder的虚拟分型标准物，因此bin在没有allelic ladder时可作为分型的标准。更多的allelic ladder及bin可以为基因分型分析提供更全面的参照。如图6所示，当基因座D21S11分型存在微变异时，由于PowerPlex®21存在30.3的虚拟bin，软件分析后自动标注为30.3，而STRtyper-21G Plus只能标注为off-ladder，需要后期人工识别。因此，在国产化的试剂盒中，STR基因座要设计符合中国人群的allelic ladder和bin，如Penta E基因座在欧洲人群检测的等位基因数量明显少于亚洲人群[8]，所以STRtyper-21G Plus与PowerPlex®21试剂盒的allelic ladder均为5～24，但STRtyper-21G Plus试剂盒的bin为4～28，而PowerPlex®21试剂盒为4～25。为提高allelic ladder分型的正确率，不要将其采用同一个毛细管电泳(即放在1个96孔板的不同位置，如6H和12F)；同时为了防止引物设计不同而使分析软件错误分型[9-10]，一般先用一种软件(如GeneMarker®HID或IDproof)分析，再用另外一种软件(如GeneMapperID-X)复核分析，无误后再输入DNA数据库。总之，使用国产STR试剂盒进行DNA检验，一定要确定off-ladder的位置(ladder之内、ladder之外size之内或是size之外)，切不可盲目标记。

综上，STRtyper-21G Plus试剂盒分型结果准确，提高了系统检测效能，采用本文优化方法用于纸质血样的批量检验，不仅减少了操作流程和污染机会，而且具有较高的成功率和较好的稳定性、均一性，适合于DNA数据库纸质血样的快速批量检验。

[1] Gill P.A new method of STR interpretation using inferential logic development of a criminal intelligence database[J].Int J Legal Med，1996，109(1):14-22.

[2] 刘亚举，郭利红，史绍杏，等.河南汉族人群39个STR基因座遗传多态性[J].法医学杂志，2014，30(3)：217-220.

[3] 刘亚举，史绍杏，郭利红，等.河南汉族人群21个STR基因座遗传多态性[J].中国法医学杂志，2014，29(4)：367-369.

[4] 刘亚举，孙现锋，薛小琦，等.河南汉族人群7个STR基因座遗传多态性[J].中国法医学杂志，2014，29(3)：262-263.

[5] Wang De Y, Chang C W, Lagacé R E, et al.Developmental validation of the AmpFLSTR®Identifiler®Plus PCR amplification kit[J].J Forensic Sci,2012,57(2):453-465.

[6] 赵兴春，姜伯玮，季安全，等.荧光STR直接复合扩增试剂缓冲体系的研制[J].中国法医学杂志，2012，27(5)：359-363.

[7] 刘琳，项林平，胡志敏，等.FTA卡血样快速直接PCR扩增方法比较初探[J].中国法医学杂志，2014，29(3)：191-193.

[8] John W P,Thomas M R,Christopher M K,et al.Distribution of Penta B, Penta C, and Penta E alleles in Asian, Black, Caucasian, and Hispanic populations[J].J Forensic Sci, 2005, 50(4):1-3.

[9] 苑美青，凃政，李万水，等.光谱校准异常导致STR分型误判1例[J].刑事技术，2009，34(5)：49-51.

[10]王琴，王东京.STR图谱分析中的问题及对策[J].刑事技术，2013，38(6)：59-60.

2015-01-23

1.许昌市公安局刑事科学技术研究所，河南许昌 461000 2.襄城县公安局刑侦大队，河南襄城 461700 3.宁波海尔施基因科技有限公司，浙江宁波315000

刘亚举(1978-)，男，河南襄城人，副主任法医师，从事DNA检验及法医遗传学统计工作。

DF795.2

B

1672-688X(2015)02-0142-04