深圳地区2014年柯萨奇病毒A组4型VP1区基因特征分析

姚相杰，何雅青，蔡春林，卓 菲，杨贵清

深圳地区2014年柯萨奇病毒A组4型VP1区基因特征分析

姚相杰1，何雅青1，蔡春林2，卓 菲2，杨贵清2

目的 对2014年深圳市罗湖区一起疱疹性咽峡炎疫情的病原体进行鉴定，并对鉴定的柯萨奇A4病毒(CVA4)的VP1基因进行序列测定和遗传进化特征分析。方法 采集疫情中患儿的咽拭子样本8份,提取病毒核酸,利用荧光RT-PCR法检测样本总肠道病毒(EV)、人肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CVAl6)、CVA4、CVA6和CVAl0等，对CVA4阳性样本采用RT-PCR方法扩增其VP1区全长序列,并进行核苷酸序列测定和遗传进化分析。结果 引起此次疱疹性咽峡炎暴发的病原体为GIB亚型的CVA4病毒。同源性分析显示，深圳2014年CVA4病毒株与云南2004年分离株(AB268278)、以及台湾2008年分离株(AB571570)核苷酸同源性达94.1%～94.8%,而与CVA4原型株HIGHPOINT同源性最低，为84.3%。在氨基酸序列上与台湾2006年分离株(AB571563)、吉林2006年分离株(JQ715709)同源性最高，达99.3%;而与山东省2006年分离株(GQ253375)同源性最低，为97.1%。相比深圳2009年分离株(HQ728260)，共有6个氨基酸突变位点：N22S,T34A，N63S，A165D，T200A和V126A；而进化树分析显示，深圳2014年CVA4病毒株虽属于CVA4的GIB亚型，但在进化走势上,已经不同于GIB亚型中其他地区早期的分离株。结论 2014年深圳地区CVA4病毒属于GIB亚型，但在VP1区变异较大。

疱疹性咽峡炎；柯萨奇病毒A组4型；VPl序列分析；亚型

人肠道病毒(Human Enterovirus, HEV)根据其基因亲缘性关系可分为A、B、C、D4组。其中A组HEV目前已知包括17个血清型，分别是柯萨奇病毒A组(Coxsackievirus A, CVA)2～8、10、12、14、16型，EV71、76、89～92型[1-2]。引起手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease, HFMD)的最主要病原体是 A组HEV中的71型(EV71)和CVA 16型(CVA16)[3-4]。其它血清型的HEV，如CVA 2、4、5、7、10型也可引起HFMD。柯萨奇病毒A4(coxsackievirus A4, CVA4)是能引起HFMD的A组HEV的一种， 也是疱疹性咽峡炎的重要病原体,目前国内尚未见由CVA4感染引起手足口病和疱疹性咽峡炎疫情的报道。本文对2014年深圳市罗湖区某幼儿园暴发的一起疱疹性咽峡炎疫情进行了病原学分子鉴定，同时,对鉴定的CVA4阳性样本VPl的全长序列进行了分子进化分析。

1 材料与方法

1.1 样本采集和核酸提取 样本来源于2014年5月深圳市罗湖区某幼儿园暴发的一起疱疹性咽峡炎疫情。患病人数8人,采集咽拭子样本8份。采用Roche公司的病毒RNA提取纯化试剂盒,取咽拭子标本加入5 mL的Hanks液重悬后，涡旋振荡1 min后，4 ℃ 8 000 r/min离心5 min，取200 μL上清液，使用瑞士Roche公司的High Pure viral RNA kit试剂盒提取病毒RNA，洗脱体积为50 μL，-80 ℃保存。

1.2 实验材料 病毒RNA提取纯化试剂盒购自罗氏公司；RNA反转录试剂盒购自TaKaRa公司；手足口病病原体的实时荧光RT-PCR试剂购自深圳市太太基因股份有限公司；CVA4、CVA6和 CVA10病毒的RNA 荧光PCR 检测试剂盒均购自深圳市易瑞生物有限公司；PCR引物合成及序列测序均由大连宝生物工程有限公司完成。

1.3 实时荧光RT-PCR检测 所有临床标本均进行实时荧光RT-PCR检测，RNA提取按照说明书进行操作；先应用实时荧光RT-PCR检测总肠道病毒EV、EV71及CAl6病毒核酸，对于EV核酸阳性、EV71型和CVA16型核酸阴性的样本判定为其他肠道病毒，然后进行CVA4、CVA6和 CVA10病毒检测，CVA4病毒检测的反应条件为45 ℃20 min,1个循环，95 ℃ 10 s 1个循环, 95 ℃ 5 min，53 ℃ 1 min，45个循环。CVA6病毒检测的反应条件为42 ℃ 8 min,1个循环，95 ℃ 10 s 1个循环, 95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，45个循环。CVA10病毒检测的反应条件为50 ℃15 min,1个循环，95 ℃ 3 min 1个循环, 95 ℃ 15 s，55 ℃ 40 s，45个循环。均严格依据说明书操作。

1.3 RT-PCR扩增及序列测定 荧光定量PCR检测结果提示为CVA4病毒阳性,于是挑选Ct值较低的4个样本参照 CVA4 (GenBank：HQ728260,深圳CVA4病毒2009年分离株)全基因组序列设计引物并扩增VP1基因全长。取3 μL反转录好的病毒cDNA为模板，以25 μL反应体系进行PCR反应扩增病毒VP1基因片段。上下引物序列分别为：CoxA4 VPl-up：5′GGTGATGCAATTGCCGATGCTAT3′；CoxA4 VPl-down：5′ TGCGAGCGTTGCTCAGCGTTGTA3′。使用1.5%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析。序列测定由大连宝生物工程有限公司完成，然后利用ClustalX，bioedit、DNAStar软件中的MegAlign等软件进行序列间的核苷酸的同源性比较，并MEGA6.0软件构建进化树，对扩增的CVA4病毒的VP1区进行型别分析。并用DNASTAR软件进行氨基酸突变分析。

2 结 果

2.1 肠道病毒型别鉴定和病毒VP1基因的扩增 此次疱疹性咽峡炎疫情，共采集样本8份,经荧光定量PCR检测鉴定全部为CVA4病毒感染。应用RT-PCR扩增CVA4阳性样本VP1基因全长,仅4个Ct值较低的样本扩出VP1基因全长，这4个样本分别是SZ-SK14030091，SZ-SK14030093，SZ-SK14030097，SZ-SK14030098。

2.2 CVA4病毒的VP1区核苷酸序列特征分析 将扩增出的CVA4病毒的VP1区全长片段进行核苷酸的序列比对分析，发现SZ-SK14030091，SZ-SK14030093，SZ-SK14030097，SZ-SK14030098的核苷酸同源性为100%，同属于GIB亚型。同时，将本次疫情发现的4株CoxA4病毒VP1序列分别与GenBank中检索到的国内外部分CoxA4各基因型与基因亚型的VPl区进行核苷酸同源性比对，其参考序列如表1。核苷酸序列上，2014年深圳CVA4病毒株与云南2004年分离株AB268278-04-CN-163-YUNAN、深圳2009年分离株HQ728260CVA4/SZ/CHN/09以及台湾2008年分离株08-TW-05168同源性最高，达94.1%～94.8%,而与CVA4原型株HIGHPOINT同源性最低，为84.3%。

表1 序列分析中所用CVA4毒株信息

2.3 CVA4病毒VP1区氨基酸序列分析 进一步分析氨基酸序列，发现深圳CVA4病毒2014株SZ-SK14030091，SZ-SK14030093，SZ-SK14030097，SZ-SK14030098在氨基酸序列上与台湾2006年(AB571563,06-TW-03242)、2007年分离株(AB571560,07-TW04122)，以及吉林2006年分离株JQ715709同源性最高，均达99.3%;与山东省2006年分离株GQ253375-06-CN-06236-SD同源性最低，为97.1%。相对于深圳CVA4病毒2009年分离株(HQ728260)，深圳2014年分离株变异较大，共有6个氨基酸突变：N22S,T34A，N63S，A165D，T200A和V126A。

2.4 CVA4 VPl区系统进化亲缘关系分析 应用Mega5.05软件中Neighbor-Joining方法对2014年深圳CVA4病毒株和24株GenBank中的代表株基于VPl基因序列构建系统进化树进行分析。由图1显示，此次扩增的深圳地区CVA4病毒均属于G1基因群的GIB亚型。进化树上看，2004年云南株AB268278，吉林2006年的一株分离株JQ715709，山东2006和2008年分离株(GQ253372，GQ253375)均与台湾2006,2007,2009年分离株(AB571560、 AB571563和AB571574))来自一个进化分支，而山东2010年分离株(KF150144)，云南2012年分离株AB759895,深圳2009年分离株(HQ728260)与台湾2008年分离株(AB571570)来自同一个分支。同源进化分析结果标明，2014年深圳地区的CVA4病毒株虽属于GIB亚型,但已经独立形成一个分支。

3 讨 论

图1 2014年深圳CVA4和各基因型代表株CVA4 VP1段系统进化分析

Fig.1 Phylogenetic analysis of CVA4 amplified in Shenzhen and other representative CVA4 strains based on VP1 full length sequences

CVA4病毒属于肠道病毒A组成员，该组成员包括柯萨奇病毒A组的16、4、5、7、9、10型以及肠道病毒71型，其中柯萨奇A16病毒和EV71病毒是引起我国手足口病的主要病原体。近年来，由于引起手足口病的病原谱发生变化，非EV71和非CVA16阳性的其他肠道病毒阳性比例逐渐增大，EV71和CVA16的比例有所下降，CVA4病毒逐渐引起人们的关注。CVA4 属于柯萨奇病毒A 组成员，其基因组为单股正链RNA，长度约为7 435个核苷酸，仅含有一个开放读码框架(Open Reading Frame, ORF)，编码4个结构蛋白(VP4、VP2、VP3、VP1)和7个非结构蛋白[5]，可引起疱疹性咽峡炎和手足口病。2004年、2006年我国台湾地区先后2次出现CVA4病毒引起的手足口病大暴发，而2010年又与CVA16的共循环，而北京、吉林、广州等地虽未报道由CVA4引发的暴发疫情，但也在手足口病患儿的粪便样本中检测到了该病毒的存在。CVA4病毒的传播流行已经给婴幼儿健康带来潜在的威胁[6-7]。

本研究应用分子生物学方法对2014年深圳市罗湖区某幼儿园的一起疱疹性咽峡炎疫情的病原体进行了鉴定。荧光RT-PCR检测结果显示，引起2014年深圳市罗湖区某幼儿园疱疹性咽峡炎疫情的病原体为CVA4病毒。为进一步了解该病毒在深圳地区的分子进化特点，又对其中4份Ct值较低的样本VP1区进行了序列测定。结果显示此次疫情中的4个CVA4病毒样本SZ-SK14030091，SZ-SK14030093，SZ-SK14030097，SZ-SK14030098的核苷酸和氨基酸同源性均为100%，这进一步证实这些病毒株样本来自同一起疫情。上述结果表明，深圳地区存在着CVA4病毒大范围流行的可能性。本研究系国内首起有关CVA4病毒导致的疱疹性咽峡炎疫情的报道，由于有关CVA4病毒所导致的手足口病和疱疹性咽峡炎的临床症状和预后尚不清楚，因此在未来将进一步加强对CVA4病毒的监测和观察。由于目前国内外对CVA4病毒的研究报道相对还是较少，为了阐明深圳地区CVA4病毒株的分子流行病学特征，探讨CVA4病毒深圳株与国内外其他地区分离株的区别和联系，本研究对该病毒进行了核苷酸和氨基酸序列的遗传进化分析。结果显示，深圳CVA4病毒2014株与云南2004年分离株AB268278同源性最高，达94.8%，其次为台湾2008年分离株AB571570，达94.5%；而在氨基酸序列上与台湾2006年分离株(AB571563)、吉林2006年分离株(JQ715709)同源性最高，达99.3%，而进化树分析则显示深圳2009年(HQ728260)、2014年CVA4病毒株(SZ-SK14030091，SZ-SK14030093，SZ-SK14030097，SZ-SK14030098)与台湾地区的CVA4病毒株均属于CVA4的GIB亚型，由于台湾地区在2004,2006年两度暴发CVA4病毒导致的手足口病疫情，而在中国大陆目前尚未见有关CVA4病毒导致的手足口病疫情或疱疹性咽峡炎疫情暴发的报道，提示深圳地区CVA4病毒株与台湾株有着较为紧密的联系。同时，相比深圳2009 CVA4病毒株，深圳2014年CVA4病毒株在进化走势上发生了变化，在CVA4病毒GIB亚型内部已经形成了一个独立分支(见图1)。此外，深圳CVA4病毒2014株(SZ-SK14030091，SZ-SK14030093，SZ-SK14030097，SZ-SK14030098)相对于2009株(HQ728260)在氨基酸位点发生了较大改变，共有6个氨基酸突变位点：N22S,T34A，N63S，A165D，T200A和V126A，这些突变是否改变对CVA4病毒的毒力大小，改变CVA4病毒的传播流行规模值得关注。

总之,CVA4病毒是引起2014年深圳市罗湖区某幼儿园疱疹性咽峡炎疫情的病原体，鉴于该病毒在2004、2006年曾引起我国台湾地区手足口病疫情大暴发，因此在手足口病监测中除了对EV71和CVA16等常见病原的检测外，还应加强对CVA4等不常见病原的分型鉴定及分子流行病学分析，及时了解科萨奇病毒的病原分布及变异情况，进而为制定科学有效的防控措施提供依据。

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HE Ya-qing, Email: heyaqing1019@126.com

Gene mutation of coxsackievirus A4 VP1 from Shenzhen, China, 2014

YAO Xiang-jie1,HE Ya-qing1,CAI Chun-lin2,ZHUO Fei2,YANG Gui-qing2

(1.LaboratoryofInfectiousDiseasesandSurveillance,ShenzhenCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenzhen518055,China; 2.LuohuCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenzhen518020,China)

We identified the pathogen causing an outbreak of herpangina in Shenzhen in 2014. Phylogenic analysis was carried out on VP1 genetic region of coxsackievirus A4 isolated from this outbreak. Eight throat swab specimens were collected from patients during the outbreak. The RNA was extracted from the virus and real-time RT-PCR method was used to test virus such as human enterovirus71, coxsackievirus Al6, coxsackievirus A4, coxsackievirus A6, and coxsackievirus A10. Complete VP1 gene of CVA4 identified in the outbreak was amplified by RT-PCR technique. Phylogenetic trees based on entire and partial VP1 sequences were constructed among CVA4 gene and others published in GenBank. It showed that CVA4 with GIB type was the pathogen in this outbreak. Data from homological comparisons indicated 4 CVA4 strains amplified in this outbreak had the highest nucleotide acid identity with the isolates from Yunnan in 2004 (AB268278), Shenzhen in 2009 (HQ728260), and Taiwan in 2008 (AB571570). The homologies of nucleotide sequences among them were 94.1%- 94.8%, which has the lowest identity (84.3%) with the prototype strain (HIGHPOINT strain). However, the 4 CVA4 strains amplified in this outbreak had the highest amino acid identity (99.3%) with the isolates from Taiwan in 2006 (AB571563), Jilin in 2009 (JQ715709), and the lowest amino acid identity (97.1%) with the isolates from Shandong in 2006 (GQ253375). Comparing with the CVA4 isolate from Shenzhen in 2009, 6 amino mutation were found in the four CVA4 strain (N22S,T34A, N63S, A165D, T200A and V126A ). Result of the analysis on phylogenetic tree showed that the 4 CVA4 stains were still belong to GIB subtype, however, it is obviously different with other stains in GIB group gained in other place in different time. In conclusion, the four CVA4 stains identified in Shenzhen, 2014 belongs to GIB subtype, which were found to have great difference on VP1 region.

herpangina; coxsackievirus A4; VP1 sequence analysis; subtypes

何雅青，Email: heyaqing1019@126.com

1.深圳市疾病预防控制中心重大传染病监控实验室，深圳 518055; 2.深圳市罗湖区疾病预防控制中心微生物检验科，深圳 518020

Support by Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province,China(No.A2013602)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.015

R373.2

A

1002-2694(2015)06-0565-04

2014-10-11；

2015-03-15

广东省医学科研基金(No.A2013602)