乙型肝炎病毒对人肝癌细胞脂类代谢相关蛋白表达的影响

颜彩玲，彭仙娥，吴云丽，林 旭，陈婉南

乙型肝炎病毒对人肝癌细胞脂类代谢相关蛋白表达的影响

颜彩玲，彭仙娥，吴云丽，林 旭，陈婉南

目的 从mRNA水平和蛋白水平检测乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)对人肝癌细胞脂类代谢相关蛋白表达的影响。 方法 以HBV细胞株或以1.2倍体HBV基因组瞬时转染人肝癌细胞株，采用实时定量PCR和Western blot方法验证人肝癌细胞载脂蛋白AI(apolipoprotein A-I，ApoAI)、载脂蛋白E(apolipoprotein E， ApoE)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD 2)、NADPH脱氢酶(醌)1(NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1，NQO 1)，以及肝型脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein 1，FABP 1)和乙酰辅酶A乙酰转移酶2(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2，ACAT 2)等脂类代谢相关蛋白表达水平的改变。结果 HBV细胞株或瞬时转染HBV均使人肝癌细胞SOD 2、NQO 1基因的mRNA和蛋白表达量下调，FABP 1基因的mRNA和蛋白表达量上调。结论 HBV可影响人肝癌细胞脂类代谢相关蛋白表达，为HBV致肝细胞脂肪变机制的深入研究打下良好基础。

乙型肝炎病毒；脂类代谢；肝细胞

近年来，乙型肝炎病毒感染与肝细胞脂肪变(hepatocellular steatosis)的关系引起了学者们的关注，并对其相关机制进行了探讨[1-2]。本课题组采用双向电泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE)分析RHBV-3细胞株(含1.2倍体HBV基因组重组载体稳定转染的HepG2细胞株)和RepSal-1细胞株(含对照空载体稳定转染的HepG2细胞株)蛋白表达差异时发现，HBV对HepG2细胞蛋白表达的影响涉及一大类脂代谢相关蛋白的改变，包括两种载脂蛋白：载脂蛋白AI(apolipoprotein A-I，ApoAI)、载脂蛋白E(apolipoprotein E， ApoE)，与两种抗氧化蛋白：超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD 2)、NADPH脱氢酶(醌)1(NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1，NQO 1)表达减少；以及肝型脂肪酸结合蛋白1(fatty acid binding protein 1，FABP 1)和乙酰辅酶A乙酰转移酶2(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2，ACAT 2)表达增高[3]。现有研究表明脂类代谢相关蛋白表达的异常与肝细胞脂肪变存在一定的联系[4]。本研究采用实时定量PCR和Western blot方法进一步验证HBV对上述脂类相关蛋白表达的影响，以探讨其作为HBV致肝细胞脂肪变作用机制中分子标志物的可能性，为HBV致肝细胞脂肪变作用机制的进一步研究提供线索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与细胞 重组质粒pRep-HBV为1.2倍体B基因型HBV基因组克隆于真核表达载体pRep10(Invitrogen公司)，对照质粒pRepSal为pRep10质粒去除表达盒得到；RepSal-1与RHBV-3细胞株为pRepSal与pRep-HBV质粒分别转染HepG2细胞并经潮霉素筛选获得，后者能稳定表达HBV表面抗原、e抗原，分泌病毒颗粒并在细胞中持续复制[5]。以上质粒与细胞株由本实验室构建与保存。肝癌细胞株Huh7、YY及HepG2购自上海细胞库。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基及胎牛血清、Trizol试剂购自Invitrogen公司。实时定量PCR引物由上海博尚生物技术有限公司设计并合成。反转录试剂盒、Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix试剂盒购自Stratagene公司。FuGENE 6 转染试剂、CDP-Star化学发光显色底物购自Roche公司。RIPA 蛋白裂解液(强)和BCA蛋白定量试剂盒、牛血清白蛋白购自江苏海门市碧云天生物技术研究所。兔抗人-FABP 1抗体购自Abcam公司；兔抗人-ApoAI抗体、羊抗人-ACAT 2抗体、羊抗人-SOD 2抗体、鼠抗人-NQO 1抗体、鼠抗人-ApoE抗体、鼠抗人-β-tubulin抗体、驴抗羊IgG-AP、羊抗鼠IgG-AP、羊抗兔 IgG-AP均购自Santa Cruz公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自厦门泰京生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及瞬时转染 RHBV-3和RepSal-1细胞株复苏后以含250 μg/mL Hygromycin B、10%胎牛血清的DMEM培养液常规培养，使用前每株细胞各接种2.5×106个细胞到60 mm培养皿。HepG2、Huh7、YY细胞以含10%胎牛血清的DMEM培养液常规培养。转染前分别按6×105细胞/孔接种于6孔细胞培养板，20 h后取3 μg pRep-HBV和相同分子数的pRepSal质粒，以FuGENE 6 转染试剂转染细胞，具体操作见说明书。

1.2.2 实时荧光定量PCR 使用Trizol试剂，将接种后48 h的RHBV-3和RepSal-1细胞，或转染后48 h的HepG2、Huh7、YY细胞提取总RNA。RNA提取过程及总RNA反转录为cDNA均按试剂盒操作说明进行。荧光定量PCR的反应体系如下：正、负引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ROX Reference Dye 0.375 μL ，Brilliant II SYBR Green QPCR master mix 12.5 μL，模板cDNA 2 μL，加水补至25 μL，每份样品、每个目的基因做3个复孔；反应条件为：预变性95 ℃，10 min；变性95 ℃，30 s；扩增60 ℃，1 min；共进行45个循环。各目的基因实时定量PCR引物序列见表1。对目的基因的差异表达倍数进行相对定量：每份模板、每个目的基因的3个复孔扩增得到Ct值(荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的扩增循环数)，取其平均值得到一个平均Ct值；每份模板的目的基因的平均Ct值减去该模板内参基因(GAPDH)的平均Ct值，得到ΔCt值；将HBV表达细胞(RHBV-3或pRep-HBV瞬时转染细胞)的ΔCt值减去对照组(RepSal-1细胞或pRepSal瞬时转染细胞)的ΔCt值，得到ΔΔCt值；每个目的基因在该HBV表达的模板中的平均相对含量为2-ΔΔCt，相应对照组该值为1。上述实验重复3次，对提取的RNA分别进行逆转录及实时荧光定量PCR扩增，所得实验结果取平均值，并计算标准差。

表1 实时定量PCR引物序列

1.2.3 Western Blot检测蛋白表达水平 将接种后48 h的RHBV-3和RepSal-1细胞，或转染后48 h的HepG2、Huh7、YY细胞以冰预冷PBS洗涤细胞，加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂PMSF)裂解细胞，获得细胞总蛋白并使用BCA蛋白定量试剂盒定量。取等量20 μg蛋白，15% SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜，以5% BSA封闭过夜。ApoAI抗体、ACAT2抗体、SOD2抗体、NQO1抗体、ApoE抗体分别以5% BSA作1∶200稀释，FABP1抗体以5% BSA作1∶1 000稀释，4 ℃孵育过夜，相应的二抗分别以5% BSA作1∶1 000稀释，室温孵育2 h，CDP-Star化学发光法曝光并显影于X光胶片。β-tubulin作为内参照。上述实验重复3次，将扫描获得的灰度值取平均值，并计算标准差。

1.2.4 统计学分析 应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，针对同一目的基因，HBV表达细胞与对照的比较分析采用单样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实时荧光定量PCR分析目的基因mRNA水平变化 本实验室在前期研究中通过双向电泳测定RHBV-3和 RepSal-1两株细胞总蛋白质的差异表达情况，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF质谱)鉴定出50种差异表达蛋白质，其中包含6种脂类代谢相关蛋白：ApoAI，ApoE，SOD 2，NQO 1表达降低，FABP 1和ACAT 2表达增高。本研究首先以实时定量PCR验证上述6种基因转录水平差异情况，提取1.2倍体HBV基因组稳定表达或瞬时转染细胞的总RNA，逆转录为cDNA，以特异性引物扩增目的基因，相对定量目的基因的差异表达情况，结果显示(图1)：与对照细胞株相比，RHBV-3细胞株中FABP1的表达量增高8.6倍，SOD 2、NQO 1及ApoE的表达量分别降低68%，60%和64%，差别均具有统计学意义(P<0.05)；ApoAI和ACAT 2的表达量在RHBV-3细胞株与对照RepSal-1细胞株中的表达差别没有统计学意义。瞬时转染结果显示(图2)，与pRepSal转染组相比，转染pRep-HBV质粒的HepG2、Huh7及YY细胞中，FABP 1表达量分别升高7.3倍，7.2倍，6.3倍；ACAT 2的表达量分别升高7.8倍，5.5倍，8倍；SOD 2表达量分别降低72%，60%，48%；NQO 1表达量分别降低68%，60%，67%；ApoE表达量分别降低75%，10%，33%，差别均具有统计学意义(P<0.05)；ApoAI的表达量在实验组和对照组中的差别没有统计学意义。

* Compared to RepSal-1 cell strains,P<0.05.

图1 实时定量PCR检测RHBV-3和RepSal-1细胞目的基因mRNA表达情况

Fig.1 Relative expression level of different genes in RHBV-3 and RepSal-1 cells by real-time PCR

* Compared to the cells transfected with pRepSal,P<0.05.

图2 实时定量PCR检测HepG2细胞、Huh7细胞、YY细胞瞬时转染pRep-HBV和pRepSal后目的基因mRNA表达情况

Fig.2 Relative expression level of target genes in HepG2, Huh7 and YY Cells transfected with pRep-HBV or pRepSal by Real-time PCR

2.2 Western Blot验证脂类代谢相关蛋白差异表达 提取RHBV-3和RepSal-1细胞总蛋白，以特异性抗体Western Blot检测上述6种蛋白的差异表达情况，条带经灰度扫描后，用β-tubulin的灰度值进行标准化，分析结果显示(图3)，与RepSal-1细胞相比，RHBV-3细胞ApoE蛋白表达量下调66%，NQO1蛋白表达量下调35%，ApoAI蛋白表达量下调72%，SOD 2蛋白表达量下调54%，FABP 1蛋白表达量上调2.14倍，ACAT 2表达变化不明显。瞬时转染pRep-HBV、pRepSal的细胞提取蛋白，重复实验结果表明(图4)：与pRepSal转染组相比较，转染pRep-HBV质粒的HepG2、Huh7及YY 3株细胞中，NQO 1蛋白表达量均下调，分别下调35%，50%，45%；转染pRep-HBV质粒的HepG2和Huh7细胞中ApoAI蛋白表达量下调，分别下调33%和38%，但在YY细胞中的表达无明显变化；SOD 2蛋白表达量在3株细胞均下调，分别下调36%，60%，44%；FABP 1蛋白表达量均上调，上调倍数分别为2.13、1.51和1.55倍；转染pRep-HBV质粒的HepG2、Huh7和YY细胞中ACAT 2和ApoE蛋白表达量均无明显变化。

* Compared to RepSal-1 cell strains,P<0.05.

图3 Western bolt检测RHBV-3和RepSal-1细胞株ACAT 2、ApoE、NQO 1、ApoAI、SOD 2及FABP 1的表达

Fig.3 Western blot analysis of ACAT 2, ApoE, NQO 1, ApoAI, SOD 2 and FABP 1 protein expression in RHBV-3 and RepSal-1 cell lines

3 讨 论

本研究在前期双向电泳结果的基础上，通过1.2倍体HBV基因组的稳定转染细胞株及瞬时转染实验验证，HBV对ApoAI、ApoE、SOD 2、NQO 1、FABP 1、ACAT 2等6个脂类代谢相关蛋白表达水平的影响。结果显示，在6个脂类代谢相关蛋白中，SOD 2，NQO 1和FABP 1在瞬时转染实验中的分析结果与稳定表达HBV蛋白的肝癌细胞株获得的分析结果完全一致，其中SOD 2、NQO 1基因的转录水平和蛋白水平表达下调，FABP 1基因的转录水平和蛋白水平表达上调，变化趋势与双向电泳分析结果一致[5]。提示SOD 2、NQO 1、FABP 1可能是HBV致肝细胞脂肪变分子机制中重要的标志物，其具体的作用机制有待于进一步的研究。本研究中HBV对ApoE、ApoAI和ACAT 2共3个基因表达水平的影响，在实时定量PCR和Western blot实验中的结果不完全一致，可能原因为转录水平和蛋白水平是基因表达调控的不同层次，蛋白表达水平受更多因素的影响，如mRNA的稳定性，翻译效率，修饰折叠和蛋白稳定性等因素。

氧化应激在非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)发病机制中起重要作用[1]，SOD 2是线粒体中重要的抗氧化蛋白，是细胞内清除反应性氧化物(Reactive oxygen species，ROS)的主要物质。有研究表明，NAFLD患者肝脏中的SOD活性降低、脂质堆积，脂质过氧化导致丙二醛(malondialde-hyde，MDA)和4-羟基乙酸(4-hydroxyoneal，HNE)释放，MDA和HNE通过共价键与蛋白结合可引起免疫性肝炎[6-7]，SOD酶活性降低的ob/ob小鼠也更易发展为非酒精性脂肪肝炎[8]。NQO 1是体内一种重要的Ⅱ相反应酶，以NAD(P)H为受体，可将NADH或NADPH的电子传递给已知或未知的内源性底物及外源性的醌类及其衍生物，发生双电子还原反应，生成低毒的氢醌类化合物[2]。有研究表明，与野生型小鼠相比，NQO 1基因剔除小鼠NAD(P)H在细胞内堆积从而改变细胞内的氧化还原状态，表现为抑制磷酸戊糖途径及加强外周组织脂肪动员，从而导致其肝脏和血浆中甘油三酯含量增加，并出现胰岛素抵抗现象[3]，胰岛素抵抗与NAFLD的发生密切相关[9]。FABP 1可结合脂肪酸，对脂肪酸具有摄取与转运功能，在肝脏的脂类转运中扮演重要角色。有研究表明FABP 1基因剔除小鼠对脂肪酸摄入和利用能力缺陷，降低了生酮作用和脂蛋白的生成，减少了肝脏的脂肪变性[10]。在高脂饲养的小鼠非酒精性脂肪肝形成过程中则发现FABP 1的表达明显增强，并与肝脏脂肪变程度密切相关[11]。这些发现均提示，FABP 1、NQO 1和SOD 2是参与肝脏脂质代谢的重要基因，当表达异常时可导致肝细胞某些功能的改变，如脂质摄取增加、脂质转运障碍以及脂质的β氧化受损，从而破坏了肝脏脂质代谢的稳态，进一步导致各种形式脂肪肝。

本研究根据前期双向电泳实验的初步结果，从转录水平和蛋白水平进一步证实了HBV对脂类代谢相关基因SOD 2、NQO 1、FABP 1的影响。而上述HBV对相关基因表达的影响是由HBV编码的表面抗原、核心抗原、e抗原及DNA聚合酶等蛋白共同作用的结果，或是由HBV中某个编码蛋白引起的，以及其具体如何调节这些脂类代谢相关基因表达，并导致最终的生物学效应有待于进一步的深入研究。

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Chen Wan-nan, Email: catherlin_2002@163.com

Effects of hepatitis B virus on lipid metabolism related proteins in human hepatoma cell lines

YAN Cai-ling,PENG Xian-e,WU Yun-li,LIN Xu,CHEN Wan-nan

(KeyLaboratoryofMinistryofEducationforGastrointestinalCancer,KeyLaboratoryofFujianProvinceforTumorMicrobiology,SchoolofBasicMedicalSciences,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350108,China)

In this study, we aimed to investigate the effects of hepatitis B virus on lipid metabolism related proteins both in mRNA and protein levels. To address these issues, six proteins, including apolipoprotein A-I (ApoAI), apolipoprotein E (ApoE), superoxide dismutase 2 (SOD2), NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1 (NQO1), fatty acid binding protein 1 (FABP1) and acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2(ACAT2) in hepatoma cells either harboring HBV or transiently transfected with 1.2×length of HBV genome, were detected by real-time PCR or western blot analysis. Results revealed that HBV could down-regulate the expression of SOD2 and NQO1, while up-regulate the expression of FABP1, which suggested that HBV may interfere with the expression of lipid metabolism proteins, and attribute to hepatocellular steatosis.

Hepatitis B virus; lipid metabolism; hepatocytes

国家自然科学基金面上项目(No.81271822)；福建省教育厅科技项目(No. JK2009014)；福建医科大学博士启动基金(No.2010BS004)联合资助课题

陈婉南，Email: catherlin_2002@163.com

福建医科大学基础医学院，“消化道恶性肿瘤”省部共建教育部重点实验室，福建省肿瘤微生物学重点实验室，福州 350108

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81271822), the Science Project of the Education Department of Fujian Province (No. JK2009014), and the Research Fund for the Doctoral Program of Fujian Medical University (No. 2010BS004)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.014

R373.2

A

1002-2694(2015)06-0560-05

2015-02-27；

2015-05-27