适合于基础实验教学的细胞凋亡检测方法探索

王宏刚，徐欣欣，陈成彬，王春国，陈 力，宋文芹，白艳玲，张金红，刘 方

（南开大学 生物实验教学中心，天津 300071）

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是研究最为深入的细胞死亡方式之一，在细胞的生命周期中发挥着非常重要的生理学意义［1］。通过对细胞凋亡的检测来评价细胞的生长状态已经成为普遍使用的方法，被普遍应用在药物的细胞毒性研究等多个领域［2－5］。在本科生的基础性实验课程中设计“细胞凋亡的检测”实验，可以帮助学生系统地学习检测细胞凋亡的方法，掌握处于凋亡过程中细胞形态及其核酸发生的变化。检测细胞凋亡的方法有很多，但适合本科生基础性实验教学的方法并不多。目前，针对细胞凋亡检测方法的训练也大多在综合性或开放性实验中进行［6－8］。探索如何在本科生的基础性实验教学中开设细胞凋亡检测实验，培养学生掌握快速、简便地检测细胞凋亡的方法就显得尤为重要。

1 实验材料与试剂

材料：小鼠淋巴瘤EL4细胞系（以下简称EL4细胞）

试剂：1 640培养基、胎牛血清、双抗、VP－16、凋亡DNA Ladder快速提取试剂盒、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、EB、PBS缓冲液、吖啶橙、台盼蓝

2 实验方法

2.1 DNA梯状带电泳检测细胞凋亡

向生长良好的EL4细胞中加入终浓度为0.1 mmol/L的 VP－16，继续培养36～48h，离心收集细胞。使用“凋亡DNA Ladder快速提取试剂盒”提取DNA。1.5%琼脂糖凝胶低电压（2～4V/cm）电泳。

2.2 吖啶橙荧光染色检测细胞凋亡

向生长良好的EL4细胞中加入终浓度为0.1 mmol/L的VP－16，继续培养36～48h；取细胞悬液，滴加0.01%吖啶橙染色液（PBS缓冲液配制）染色5 min；加盖玻片，在荧光显微镜下选用宽谱紫外激发块进行激发并观察细胞发出的荧光。

2.3 台盼蓝染色法检测细胞凋亡

向生长良好的EL4细胞中加入终浓度为0.1 mmol/L的VP－16，继续培养36～48h；取细胞悬液，加入2%台盼蓝染色液染色2min；加盖玻片，在普通光学显微镜下进行观察。

3 实验结果

3.1 DNA梯状带电泳检测细胞凋亡

细胞发生凋亡的一个重要特征是其染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂。180～200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（见图1）。

图1 细胞凋亡DNA梯状带

3.2 啶橙荧光染色检测细胞凋亡

吖啶橙可以通过完整的膜结构使DNA和RNA着色。在荧光显微镜下，可观察到正常活细胞的细胞核经吖啶橙染色后呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。发生凋亡的细胞中，核呈黄绿色，断裂为多个碎块状，碎裂的核由膜包裹着凸起于细胞表面呈黄绿色（见图2）。

3.3 台盼蓝染色法检测细胞凋亡

台盼蓝不可以通过完整的细胞膜。经台盼蓝染色后，发生坏死的细胞呈蓝色。正常细胞和凋亡细胞不着色，发生凋亡的细胞在细胞膜上可见凸起的凋亡小泡（见图3）。

图2 吖啶橙染色显示凋亡细胞（箭头所示）（400×）

图3 台盼蓝染色法检测细胞凋亡（400×）

4 讨论

4.1 实验材料的选择

在设计细胞凋亡的检测实验时，实验材料的选择非常重要。本科生基础实验教学使用的细胞系应该具备培养条件简单、生长较快等特点，以降低培养的难度。如：Hela细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞、EL4细胞等都是比较合适的细胞株系。选用悬浮生长的细胞系可以省去胰酶消化细胞的步骤，使实验过程更加简洁，提高实验的成功率。

4.2 诱导方法的选择

诱导细胞凋亡的方法有很多种，如紫外线照射、药物诱导等［9－11］。其中，药物诱导有着可控性好的优点。通过选择药物的浓度和处理时间可以控制细胞凋亡的程度，以便在教学时能够向学生提供合适的实验材料，帮助学生观察细胞发生凋亡时的典型特征。

4.3 检测方法的选择

细胞凋亡的检测方法有很多，基本上分为形态学观察、DNA电泳、蛋白分子的生化检测3类［12－13］。本文选择了具有代表性的DNA梯状带电泳、吖啶橙荧光染色法和台盼蓝染色法3种实验方法为本科生开设基础实验课。DNA梯状带电泳主要是依据细胞发生凋亡时DNA在核小体连接处发生断裂的特点来对细胞的凋亡进行检测。吖啶橙荧光染色法和台盼蓝染色法根据细胞凋亡时形态的变化来检测细胞凋亡。

通过这3个代表性的实验，学生不但可以直观地观察到细胞形态发生的变化，如细胞核的变形、凋亡小泡的形成等，还可以通过了解细胞DNA断裂的方式理解细胞程序性死亡的概念。

4.4 教学的组织

作为基础实验，课时是最重要的一个限制性因素，需要在固定且较短的时间内完成实验，这就需要实验的步骤要尽量简洁。基础性实验开设的对象一般为大学一年级或二年级的学生，要求实验原理不能太深奥，实验操作不能太复杂。

相对于其他检测方法而言，吖啶橙荧光染色法和台盼蓝染色法的操作复杂度不高，每个实验均可以在1个学时内完成。DNA梯状带电泳中涉及到DNA的提取和琼脂糖电泳技术。DNA的提取使用试剂盒大约需要1个学时，琼脂糖电泳大约需要2个学时。可以在进行电泳的同时，进行吖啶橙荧光染色法和台盼蓝染色法检测细胞凋亡的实验。通过这样的安排，可以在4个学时内完成整个实验。

5 结束语

细胞凋亡的检测是生命科学类本科生实验教学中的一个重点，应该将这一知识点的教学引入基础性必修实验课程，使其成为学生牢固掌握的基本实验技能之一。在此基础上进行细胞凋亡相关的综合性实验或科研训练时的教学效果会更好，学生得到的收获也会更多。

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