雷公藤内酯醇抑制COX-2表达调控胰腺癌细胞生物学性状的实验研究

孙运良 马建霞 吴红玉 金晶 李淑德

·短篇论著·

雷公藤内酯醇抑制COX-2表达调控胰腺癌细胞生物学性状的实验研究

孙运良 马建霞 吴红玉 金晶 李淑德

雷公藤内酯醇(triptolide，TPL)是从中国传统中药雷公藤中提取的有效成分。近年来的研究发现，TPL不仅具有抗炎、抗免疫反应等多种药理作用，还具有广谱抗肿瘤作用，是一种多靶点的天然抗肿瘤药物[1-4]。实验表明，TPL能抑制体外培养的胰腺癌细胞增殖及胰腺癌动物移植瘤的生长[1]。环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)为一种诱导型酶，与多种肿瘤的发生、发展密切相关[5]。研究发现，TPL不仅可通过抑制COX-2表达调控炎症过程，还可通过下调COX-2表达抑制结肠癌细胞的增殖和迁移[2,6]。然而TPL是否也通过下调胰腺癌细胞COX-2的表达而抑制肿瘤生长目前尚不清楚。本研究应用TPL干预人胰腺癌PANC1细胞，观察其对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用，探讨其相关机制。

一、材料和方法

1．细胞增殖检测：人胰腺癌细胞株PANC1为长海医院保存，常规培养、传代。收集对数生长期细胞，调整细胞密度为5×105/ml。96孔板每孔加入100 μl细胞悬液培养过夜，待细胞贴壁后更换为无血清的DMEM培养液，并分别加入终浓度为20、40、80 ng/ml的TPL(Sigma公司，纯度≥98.0%)继续培养24、48 h。以不加TPL干预的细胞作为阴性对照，以PBS作为空白对照。每个浓度设6个复孔。培养到时间点后每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)继续培养4 h，吸去孔内培养液，加入150 μl DMSO，低速振荡10 min，上酶联免疫检测仪测各孔在波长570 nm处的吸光值(A570值)。细胞增殖率=(实验孔A570值/空白对照孔A570值)×100%。

2．细胞凋亡检测：取对数生长期细胞，以1×105/孔接种于24孔板，培养至细胞贴壁后更换培养液，分别加入终浓度为20、40、80 ng/ml TPL继续培养24 h，以不加TPL干预的细胞作为阴性对照。收集细胞，上流式细胞仪检测细胞的凋亡。Annexin V-FITC试剂盒购自晶美生物工程有限公司，按说明书操作。

3．细胞的迁移能力检测：取对数生长期细胞，以5×105/孔接种于6孔板，培养至约90%融合状态时弃去培养液，用10 μl的Eppendorf Tip在平板中间划一条横线，PBS冲洗3次，加入无血清的DMEM培养液。然后分别加入终浓度为20、40、80 ng/ml的TPL继续培养24 h，以不加TPL干预的细胞作为阴性对照。按0、24 h取样，测量划痕的距离。细胞迁移率=[(0 h划痕距离-24 h划痕距离)/0 h划痕距离]×%。

4．细胞侵袭能力检测：Transwell小室购自Coster公司。每个小室的聚碳酸酯膜上加50 μl用无血清DMEM培养液稀释的Matrigel，待其充分聚合。Transwell下室加入600 μl含10% FBS的DMEM培养液，Transwell上室加入200 μl用无血清DMEM培养液制备的5×105/ml的细胞悬液，分别加入终浓度为20、40、80 ng/ml的TPL培养24 h，以不加TPL干预的细胞作为阴性对照。培养24 h 后取出Transwell小室，用棉签拭去聚碳酸酯膜表面的Matrigel，PBS轻轻冲洗，晾干，然后用0.1%结晶紫染色膜10 min，去除多余结晶紫染液，普通光学显微镜下观察。每个干预浓度做3个小室。每个样本随机选取5个200倍视野，计数穿膜细胞数，取均值表示肿瘤细胞的侵袭能力。

5．细胞COX-2、Caspase-3、MMP-9蛋白表达检测：取各组不同浓度TPL干预24 h的PANC1细胞，用RIPA裂解液制备细胞总蛋白，测定蛋白浓度，常规行蛋白质印迹法检测COX-2、Caspase-3、MMP-9蛋白表达。以β-actin为内参。兔抗人COX-2、Caspase-3抗体，山羊抗人MMP-9抗体均购自Santa Cruz公司。最后ECL显影、胶片曝光、显影、定影。用凝胶图像软件分析系统扫描胶片，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白的相对表达量。

二、结果

1．PANC1细胞增殖的变化：TPL呈时间及浓度依赖性抑制PANC1细胞的增殖(图1)。

2．PANC1细胞凋亡的变化：阴性对照组及20、40、80 ng/ml TPL干预组的细胞凋亡率分别为(2.6±0.5)%、(4.7±1.0)%、(10.5±2.0)%、(21.1±4.2)%(图2)。各干预组PANC1细胞的凋亡率均显著高于阴性对照组，差异均具有统计学意义(P值均<0.05)。

3．PANC1细胞迁移力的变化：阴性对照组及20、40、80 ng/ml TPL干预组细胞迁移率分别为(79.3±8.2)%、(73.3±7.0)%、(51.0±6.2)%、(32.3±4.5)%(图3)。40、80 ng/ml组均显著低于阴性对照组，差异有统计学意义(P值均<0.01)，而20 ng/ml组与阴性对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。

与阴性对照组比较，aP<0.05；与24 h组比较，bP<0.05

图2 对照组(2A)及20、40、80 ng/ml TPL干预组(2B、2C、2D)PANC1凋亡细胞

4．PANC1细胞的侵袭力变化：阴性对照组及20、40、80 ng/ml TPL干预组的穿膜细胞数分别为(23.2±4.0)、(46.0±6.2)、(37.2±5.6)、(31.5±4.8)个/200倍视野。各干预组穿膜细胞数均显著高于阴性对照组，差异具有统计学意义(P值均<0.05)，但随TPL浓度的增加穿膜细胞数减少(图4)。

5．PANC1细胞COX-2、Caspase-3、MMP-9蛋白表达量的变化：随着TPL浓度的增加， PANC1细胞COX-2、MMP-9蛋白表达量逐渐下降，而Caspase-3蛋白表达量逐渐增加(图5)。

图3 PANC1细胞的迁移能力(划痕实验 ×100)

图4 对照组(4A)及20、40、80 ng/ml TPL干预组(4B、4C、4D)PANC1细胞的侵袭能力(Transwell小室 ×200)

图5 对照组(1)及20、40、80 ng/ml TPL干预组(2、3、4)PANC1细胞COX-2、Caspase-3和MMP-9蛋白的表达

讨论尽管已有大量的实验证明TPL具有抗肿瘤作用，但其确切机制尚有待于进一步明确。COX-2作为一种诱导酶，生理状态下在大多数组织中不表达或微量表达，但在炎症等病理过程中表达增加。研究证实，COX-2在胰腺癌组织中高表达[7]，使用选择性COX-2抑制剂或沉默COX-2基因后均能抑制胰腺癌细胞生长，并诱导细胞凋亡，提示COX-2在胰腺癌的发生、发展过程中有着重要的作用[8-9]。本研究结果显示，TPL抑制胰腺癌细胞增殖、促进胰腺癌细胞凋亡，同时明显抑制COX-2蛋白表达，表明COX-2是TPL抗胰腺癌的分子靶点之一。Johnson等[2]的研究也发现，TPL可通过抑制结肠癌COX-2的表达，进而抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡。

Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子。研究显示，Caspase-3是COX-2重要的下游分子；特异性COX-2抑制剂NS-398或塞来昔布均可上调Caspase-3表达，促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长[10-11]。本研究结果显示，TPL呈浓度依赖性抑制胰腺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖性抑制COX-2、促进Caspase-3表达，提示TPL通过抑制COX-2表达，促进Caspase-3表达，从而发挥抑制胰腺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。

侵袭、迁移是胰腺癌的主要生物学行为，也是影响治疗效果和预后的重要因素。Zhang等[12]的研究及本课题组前期研究[13]的结果表明，MMP-9在胰腺癌细胞中呈高表达，其过度表达与肿瘤对周围组织的侵袭及远处转移密切相关。近年的研究发现，COX-2可诱导MMP-9的产生，特异性COX-2抑制剂下调MMP-9蛋白表达，表明MMP-9是COX-2促进肿瘤侵袭和迁移的下游基因之一[14-15]。本研究结果显示，TPL亦下调胰腺癌细胞MMP-9表达，抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭。

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(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.03.017

江苏省卫生厅科研项目(Y201420)；连云港市卫生局科研项目(1242)

222100 连云港 ，江苏省连云港市赣榆区人民医院消化内科(孙运良)；上海复旦大学附属华东医院消化内科(马建霞)；第二军医大学附属长海医院消化内科(吴红玉、金晶、李淑德)

李淑德，Email：lishude57@126.com

2014-01-12)