不同栽培类型对红豆杉中紫杉醇含量的影响

曹云飞，倪慧艳，袁 松，叶 飞，刘宝华

(1.镇江市药品检验所，江苏 镇江 212003;2.镇江市第四人民医院，江苏 镇江 212001;3.中国食品药品检定研究院，北京 100503;4.江苏大学附属医院细胞治疗中心，江苏 镇江 212001;5.山东新华制药股份有限公司，山东 淄博 255087)

红豆杉又名紫衫，是一种红豆杉属的植物［1］，其主根不明显、侧根发达。自美国化学家Wani等从红豆杉中分离得到紫杉醇以来，紫杉醇以其良好的抗癌活性引发对红豆杉的研究热潮。然而，由于红豆杉属植物生长缓慢，自身繁殖率低，紫杉醇在红豆杉中含量较低，且随着全球对野生红豆杉资源保护措施的不断加强，利用野生资源生产紫杉醇已无可能。因此，如何解决原料来源问题就成了紫杉醇工业化生产的关键问题。为满足日益增长的社会需求，相关学者进行了多方面的研究:人工栽培、紫杉醇全合成、真菌培养法、器官培养法、组织及细胞培养法等;迄今为止，人工栽培依然被认为是最有效的解决途径。目前国内人工栽培已经形成了较大的规模，并已开始用于紫杉醇的生产。但人工栽培红豆杉的深入研究尚未见报道，本文建立紫杉醇的高效液相色谱测定方法，对不同栽培类型的红豆杉中紫杉醇的含量进行了研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪、Chemstation色谱工作站(美国Agilent公司);Cleanert C18SPE固相萃取柱(艾杰尔公司)。

1.2 试药 紫杉醇对照品(中国食品药品检定研究院，批号:110773－201012);超纯水自制;甲醇、乙腈为色谱纯(国药集团);其余试剂为分析纯。红豆杉A，红豆杉B，取红豆杉树枝、树干及树根经速万能粉碎机粉碎，过1.0 mm样品筛后备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［2，3］色谱柱:Venusil ASB C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);以乙腈为流动相 A，以 0.02 mol·L－1乙酸铵溶液(乙酸调节pH为5)为流动相B，按表1进行梯度洗脱;流速为1.0 mL·min－1;紫外检测波长为227 nm;柱温为40℃;进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 对照品贮备液制备 精密称取紫杉醇对照品约10 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。另精密称取紫杉醇对照品约10 mg，置200 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末3 g，用乙酸乙酯－丙酮混合溶液180 mL进行索氏提取［4］，回流8 h，冷却过夜，收集回流液。将固体物残留物加入少量提取剂经超声浸提20 min后，并入回流液;回流液于50℃旋转蒸发至近干，残留物用少量提取剂转移至5 mL容量瓶中，定溶至刻度。精密量取1 mL，置20 mL容量瓶中，用甲醇定溶至刻度。供试品溶液典型色谱图见图1。

2.4 标准曲线的制备 分别精密量取对照品贮备液2、4、6、20、50 mL，置200 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成浓度分别为 1、2、3、10、25 μg·mL－1的对照品溶液，照上述色谱条件进样检测，测定峰面积值(A)，并以A对浓度(C)进行线性回归，绘制标准曲线，线性关系［5］考察见表2。结果表明在1.022～25.55 μg浓度范围内，峰面积与紫杉醇浓度呈良好的线性关系，回归方程:A=63.199C－561.19，r=0.9987。

图1 色谱图

2.5 稳定性试验 取对照品溶液，分别于0、4、8、12 h［6］在上述色谱条件下测定，结果表明对照品溶液在12 h内稳定，RSD为0.33%。

2.6 精密度试验 取对照品溶液，在上述色谱条件下连续测定5次，RSD为0.2%，表明精密度良好。

2.7 重复性试验 按照拟订的含量测定方法，取同一棵树的树枝粉末［7］，配制供试品溶液，照上述色谱条件下测定，重复进样5针，RSD为0.1%。

2.8 回收率试验 平行取9份已知含量的样品［8］，分别加入紫杉醇 4.09、5.11、6.13 μg，按“2.4”项下所述方法操作，照上述色谱条件下测定，结果见表3。

表3 回收率测定结果(n=9)

2.9 样品测定 取不同栽培类型的红豆杉A和红豆杉B的树枝、树干及树根，照“2.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项所述方法进样检测，结果见表4。

表4 样品的含量测定结果

3 讨论

紫杉醇在红豆杉中的含量较低，目前文献报道的野生红豆杉枝叶中紫杉醇含量约在0.02%左右，而人工栽培红豆杉枝叶中紫杉醇含量约在0.01%左右，一方面可见人工栽培［9］对紫杉醇含量具有显著的影响，另一方面不同文献所报道的提取方式各有差异。另外，建立的紫杉醇的液相色谱测定法具有简便、快速、结果准确性高等特点。

从检测结果来看，红豆杉A的树枝、树干及树根中紫杉醇的含量均显著高于红豆杉B［10］，就获得更多紫杉醇的目的来说，说明红豆杉A的栽培类型(无土栽培)明显优于红豆杉B的栽培类型(传统栽培);另外无论是红豆杉A，还是红豆杉B，其各部位紫杉醇含量由大到小的顺序均依次为树根、树干、树枝，与文献报道一致。通过本研究为红豆杉的栽培技术提供了技术数据支持。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［2］刘松青，高振同，代青，等.HPLC法测定红豆杉皮粗提物中紫杉醇的含量［J］.重庆中草药研究，1999，40:63－64.

［3］何法霖，卢建伟，赵锐，等.HPLC测定加拿大红豆杉浸膏中紫杉醇的含量［J］.中国中药杂志，2007，32(8):753－754.

［4］俞培忠，李幼萍，吴锦霞.紫杉醇的提取分离和检测方法的研究进展［J］.中国药学杂志，1996，31(7):6－9.

［5］郭喜军，荣俊冬，陈礼光，等.红豆杉繁殖与栽培研究进展［J］.亚热带农业研究，2007，3(4):250 －257.

［6］柯春婷.福建省南方红豆杉中紫杉醇和10－DAB含量及其影响因子［D］.福州:福建师范大学，2009.

［7］高山林，朱丹妮，周荣汉.东亚和北美产红豆杉属七种植物中紫杉醇及短叶醇的含量［J］.中国药科大学学报，1995，26(1):8 －10.

［8］张钢民，张涛，杨文利.红豆杉属植物的研究进展［J］.河北农业大学学报，1998，21(4):104 －108.

［9］李华，李明，郑志坚，等.超临界CO2流体萃取法提取紫杉醇的研究［J］.复旦学报(自然科学版)，2003，42(3):453－456.

［10］张艳平，刘同祥.高效液相色谱法测定东北红豆杉愈伤组织中紫杉醇的含量［J］.贵阳中医学院学报，2009，31(6):81－82.