胡椒中提取纯化胡椒碱的工艺研究

徐士明，关永霞，朱祥霞，武洪英

(1.临沂市生产力促进中心，山东 临沂 276000;2.中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276000)

胡椒为胡椒科植物胡椒(Piper nigrum L.)的干燥近成熟或成熟果实，可用作调味剂、防腐剂、健胃剂、解热剂、利尿剂和支气管粘膜刺激剂等［1］。胡椒碱(C17H19NO3)为胡椒的主要活性成分，具有抗肿瘤 、抗氧化 、抗消化系统溃疡 、抗抑郁 、免疫调节等作用［2］。目前，有关胡椒中胡椒碱的提取研究已经较为深入和系统。文献报道的有关胡椒碱的提取方法主要有:酸水提取［3］、乙醇提取［4］、甲醇提取［5］、微波蒸馏提取［6］、超声提取［7］、二氧化碳超临界提取［8］等，其中酸水提取效率低，提取液后期处理比较繁琐，只适用于胡椒碱的粗提;甲醇提取率较高，但其毒性较大，工业生产不安全;微波和二氧化碳超临界提取效率较高，但设备贵，成本高;超声提取率较低，设备贵，有噪音污染。石宝俊等［9］用乙醇回流提取胡椒，本研究优化乙醇回流提取参数，考察结晶条件，筛选最佳产业化工艺，制备纯度大于98%的纯品。

1 材料与仪器

1.1 材料 胡椒(购自海南省万宁市，经中药制药共性技术国家重点实验室李守信高级工程师鉴定为胡椒科植物胡椒Piper nigrum L.);酒精(95%，食用级);甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，批号:20130621);胡椒碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号:110775－201104);无水乙醇(AR级，国药集团化学试剂有限公司，批号:20140605)。

1.2 仪器 Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000高效液相色谱仪，Ultimate 3000紫外检测器，Ultimate 3000 Chromeleon 7数据处理系统;150摇摆式高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司);ME204电子天平(梅特勒－托利多仪器有限公司);ZKSY型恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司);R1020EX旋转蒸发仪(20L，郑州长城科工贸有限公司);DZF－6050型真空干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);2XZ－2型旋片式真空泵(浙江台州真空泵有限公司);300L搪玻璃反应釜(河南永信搪瓷化工设备有限公司)。

2 实验方法

2.1 分析方法

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取胡椒碱对照品10.59mg，置100mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密移取此溶液10mL，分别置于25mL容量瓶中，用无水乙醇稀释定容至刻度，即得。

2.1.2 色谱条件 色谱柱:Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm);流动相:甲醇－水 =77∶23，检测波长343 nm。柱温为30℃;进样量10μL;流速为1.0mL·min－1。胡椒碱此条件下的保留时间约为14min。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密称取胡椒碱对照品10.59mg，置100mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀;精密移取此溶液 1、2、4、10、20mL，分别置于25mL容量瓶中，用无水乙醇稀释定容至刻度。以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程:Y=30.749X－10.679，r=0.9999，结果表明胡椒碱浓度在 4.236～84.72 μg·mL－1范围内，胡椒碱的峰面积和进样量成良好的线性关系。

2.2 提取条件优化

2.2.1 胡椒预处理的考察 准确称取胡椒粒和胡椒粉各100g，胡椒粒首先利用85%乙醇浸泡24 h，然后回流提取2次。胡椒粉直接利用85%乙醇加热回流提取2次。两者提取时间均为2 h，料液比均为1∶10，将提取液按不同倍数稀释，按“2.1”项下方法测定含量，结果见表1。

由表1可知，未粉碎胡椒，虽然浸泡24 h，但是提取效率极低，不适合提取操作。根据药典方法检测，本药材中胡椒碱含量为4.11%;粉碎后的胡椒粉回流提取2次总含量可达3.89 g，提取率超过94%，说明粉碎后胡椒碱基本提取完全，胡椒碱提取时需要对胡椒进行粉碎。

表1 胡椒粉碎对胡椒碱提取率的影响

2.2.2 提取次数的考察 称取胡椒粉2份，各100g，分别加入10倍量85%乙醇溶液，回流提取3次，每次2 h，合并滤液，稀释后，按“2.1”项下方法测定含量，结果见表2。

表2 提取次数对胡椒碱提取率的影响

由表2可知，回流提取2次即可达到最佳效率。

2.2.3 乙醇浓度的考察 称取胡椒粉9份，各100g，分别加入10倍量不同浓度乙醇溶液，回流提取2次，每次 2 h，合并滤液，稀释后，按“2.1”项下方法测定含量，结果见图1。

图1 乙醇浓度对胡椒碱提取率影响

由图1可知，乙醇浓度在55%～85%之间时，随着乙醇浓度的增加，胡椒碱提取量上升，当乙醇浓度达到85%时，提取量最高，达到3.87 g，之后随乙醇浓度升高，提取含量反而降低，表明乙醇浓度85%时提取效果最好。

2.2.4 料液比的考察 称取胡椒粉9份，各100g，选用不同料液比，加85%乙醇溶液回流提取2次，每次2 h，合并提取液，稀释后，按“2.1”项下方法测定含量，结果见图2。

由图2可知，随着提取液体积的增加，胡椒碱提取量逐渐增加，当料液比在1∶10时，胡椒碱已经基本提取完全，随着提取液体积继续增加，提取量增加不明显，从成本方面考虑，采用料液比1∶10即可保证提取率，适合产业化生产操作。

图2 不同料液比对胡椒碱提取率影响

2.2.5 提取时间的考察 称取胡椒粉8份，各100g，分别加入10倍量浓度85%乙醇溶液，回流提取1次，设定不同提取时间，将提取液稀释后，按“2.1”项下方法测定含量，结果见图3。

图3 提取时间对胡椒碱提取率影响

由图3可知，随着提取时间的延长，胡椒碱提取量逐渐增加，当提取时间达2 h后，提取量基本不增加，时间继续延长，提取总含量反而略有降低，所以选择最佳提取时长为2 h。

2.3 结晶条件优化

2.3.1 1次结晶条件的考察 提取液浓缩至无醇味，静置12 h后析出长棱状晶体，说明胡椒碱可以在浓缩液结晶析出。为进一步优化1次结晶条件，选用常温静态(室温静置)、低温静态(0～4℃静置)、低温动态(冰水浴搅拌)3种结晶条件进行考察，将1次结晶样品作为供试品检测，结果见表3。

表3 不同结晶条件效果考察

由表3可知，不同的结晶条件，结晶时间、晶型、收率有所不同。低温动态结晶晶型稍差，但结晶速度快、生产周期短，且收率远远超过静态结晶，为最佳1次结晶条件。

2.3.2 重结晶条件的考察 低温动态一次结晶品用少量冰乙醇淋洗，胡椒碱的含量约70% ～85%，为进一步提高纯度，需进行重结晶。本试验选择了石油醚、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、无水乙醇5种不同极性的溶剂进行重结晶考察，将重结晶样品作为供试品检测，结果见表4。

表4 重结晶溶剂考察

由表4可知，乙酸乙酯、无水乙醇、无水甲醇可以作为重结晶溶剂，其中乙醇毒性低，属于环境友好型溶剂，适用于产业化生产，所以最终选定无水乙醇作为重结晶溶剂，所得胡椒碱纯度大于98%(见图4)。

图4 供试品的高效液相色谱图

3 结果与讨论

本文以胡椒为试验材料，考察乙醇提取的最佳工艺，与传统酸提碱沉工艺相比，提取物后期处理简单，产品纯度高，对环境污染小。试验采用高效液相色谱(HPLC)法测定提取物中胡椒碱的纯度和提取率，作为参考指标优化工艺条件。试验结果显示，由于胡椒果实坚硬不容易浸透，所以为保证胡椒碱提取率，提取前需要经过粉碎处理。乙醇提取胡椒碱最佳工艺条件为料液比1∶10，乙醇浓度85%，回流提取2次，每次2 h，提取率可达96%。1次结晶方式为低温动态结晶，结晶速度快，收率高;通过考察胡椒碱和杂质在不同溶剂中的溶解度，综合考虑结晶晶型、溶剂毒性和环保等方面，最终选用无水乙醇作为重结晶溶剂，胡椒碱重结晶后纯度可达98%以上。本胡椒碱提取纯化工艺步骤少，使用仪器简单，操作方便，生产周期短，产品纯度高。提取采用乙醇作为有机溶剂，可重复回收利用，降低生产成本。通过中试工艺验证，收率稳定，说明生产工艺稳定可靠，能够满足工业化生产要求，适 合大规模生产。

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