VEGF-D 在结直肠癌中的表达及与微血管密度的关系

曹怀宇 成雪梅 魏磊彬

结直肠癌是消化道中常见的恶性肿瘤之一，随着对结直肠癌的发生和转移机制的深入研究，通过测定微血管密度(MVD)，发现肿瘤中新生血管数量越多癌组织发生转移的可能性越大［1］;研究表明，VEGF-D与受体结合后，能起到促进细胞分裂，毛细血管扩张，内皮细胞增殖和提高血管通透性的作用［2］。同时，VEGF-D 还能增加淋巴管系统的通透性，促使肿瘤细胞进入淋巴管。有关结直肠癌中VEGF-D 表达的研究国内外报道均较少。本研究通过免疫组化检测结直肠癌组织中VEGF-D 表达情况并探讨其与MVD 的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2008 至2012 年在中国人民解放军第251 医院就诊的的原发性结直肠癌术后标本60 例，均有明确的病理组织学诊断结果，所有患者在术前均未经任何治疗，所有病例资料完整。60 例结直肠癌患者中，男35 例，女25 例;年龄45 ～65 岁。临床分型:隆起型10 例，溃疡型36 例，浸润型5 例，其他类型9 例;组织学类型依照2003 版美国肿瘤联合会(AJCC)分类标准分类:高分化腺癌14 例，中分化腺癌23 例，低分化腺癌23 例;根据国际抗癌联盟(UICC)制定的TNM 分类标准(2003)分期:Ⅰ期的5 例，Ⅱ期17 例，Ⅲ期20 例，Ⅳ期18 例。病理证实伴有淋巴结转移41 例，无淋巴结转移19 例;有远处转移18 例，无远处转移42 例。

1.2 试剂 鼠抗人VEGF-D 单克隆抗体:美国R ＆D公司、LSAB 免疫组化试剂盒及DAB 显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法 将所选取的病例标本常规行HE 染色确定病理类型。免疫组化染色程序按LSAB 免疫组化染色试剂盒说明书进行。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，以福州迈新公司提供的阳性片作阳性对照。

1.4 结果判定 VEGF-D 的蛋白阳性产物主要表达于细胞质，以出现棕黄色颗粒记为阳性细胞，依阳性细胞占所观察细胞的百分比和着色的强度来综合计分。由两位高年资病理医师分别双盲阅片，随机选取5 个高倍镜视野计数阳性细胞百分比的平均数，按肿瘤细胞阳性细胞数量记为0 ～3 分，即阳性细胞数目为＜10%为0 分，10% ～50%为1 分，51% ～75%为2 分，＞75%为3 分;按着色强度记为0 ～3 分，即无色为0分，灰黄色为1 分，金黄色为2 分，棕黄色为3 分;最后，将两项指标的评分相加，根据总的分数分为2 级，0～2 分为阴性，≥3 分为阳性。微血管计数参照Weidner 方法［3］。

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0 统计软件，计数资料采用χ2检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF-D 在不同结直肠组织中的表达 VEGF-D蛋白在结直肠癌、结直肠腺瘤、正常组织标本中的阳性率分别是75.0%、40.0%和20%，差异有统计学意义(P ＜0.01)。见表1。

表1 VEGF-D 在结直肠黏膜、腺瘤和结直肠癌组织中的表达例

2.2 VEGF-D 的表达与结直肠癌临床、病理特征间的关系 VEGF-D 的阳性表达均与患者的TNM 分期、淋巴结转移情况以及远处转移情况相关(P ＜0.05)。见表2。

表2 VEGF-D 的表达与结直肠癌临床病理特征的关系 例

3 讨论

VEGF-D 基因位于染色体Xp22-23，含有8 个半胱氨酸残基。人VEGF-D 的cDNA 序列含有419 个碱基对，其中的开放阅读框架编码一种含有354 个氨基酸的多肽，该多肽被命名为VEGF-D 蛋白。VEGF-D可与VEGFR-2 和VEGFR-3 结合，但不能与VEGFR-1结合。研究发现，VEGFR-3 通过与VEGF-D 结合并被激活，导致淋巴管生成、增生或扩张且数目增加［1］，而淋巴管密度的增加与淋巴结转移密切相关，是促进肿瘤发生淋巴结转移的重要原因［2，4］。由于VEGF-D 能增加淋巴管道系统的通透性，促使肿瘤细胞进入淋巴管，进入淋巴管中的肿瘤细胞则又通过胸导管扩散到血管系统中，从而间接促进了肿瘤的血道转移。

有关结直肠癌中VEGF-D 表达的研究国内外报道均较少，目前的研究结果显示结直肠癌患者癌组织中VEGF-D 的表达增高。Juttner 等［5］通过分析VEGF-D与VEGFR-3 的染色结果与患者生存率之间的关系发现，VEGF-D 阳性与降低肿瘤的特异性生存率和降低无病生存率均呈明显相关。多元回归分析也显示，VEGF-D 可独立的作为消化道肿瘤特异性生存率与无病生存率的预后因子。本研究表明，在结直肠癌组织中VEGF-D 的阳性表达率明显高于结直肠腺瘤组织及正常结直肠黏膜组织。VEGF-D 的表达与患者的TNM分期、淋巴结转移情况以及远处转移情况相关。TNM分期高、伴有淋巴结转移以及有远处转移的患者VEGF-D 表达强，与刘宝全等［6］的研究结果一致。

人类VEGF-D 与VEGF-C 的序列有48%相同，牟江洪等［7］的研究认为，结直肠癌淋巴管内皮细胞增殖活跃，表明癌组织可能存在新生淋巴管，尤其是在结直肠癌浸润的边缘区域，且这些新生淋巴管与VEGF-C和VEGF-D 表达密切相关［8］，提示VEGF-C 和VEGFD 可能诱导结直肠癌尤其癌周淋巴管生成［3，9，10］。本实验结果也表明，VEGF-C 及VEGF-D 在结直肠癌的表达呈正相关，VEGF-D 在VEGF-C 阳性组中的表达明显高于其在VEGF-C 阴性组中的表达，也进一步印证了上述学者的研究结果。当然，VEGF-C 与VEGF-D在结直肠癌表达具有相关性的机制仍需要大量资料去进一步证明及探讨。

1 Cross MJ，Dixelius J，Matsumoto T，et al.VEGF-receptor signal transduction.Trends Biochem Sci，2003，28:488-494.

2 初同伟，朱佩芳.血管内生长因子的基础及临床应用研究.中国临床康复，2002，6:570-571.

3 Makinen T，Veikkola T，Mustjoki S，et al.Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth，survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3.EMBO J，2001，20:4762-4773.

4 Van der Auwera I，Van den Eynden GG，Colpaert CG，et al.Tumor lymphangiogenesis in inflammatory breast carcinoma:a histomorphometric study.Clin Cancer Res，2005，11:7637-7642.

5 Juttner S，Wissmann C，Jons T，et al.Vascular endothelial growth factor-D and its receptor VEGFR-3:two novel independent prognostic markers in gastric adenocarcinoma.J Clin Oncol，2006，24:228-240.

6 刘宝全，张雅芳，马晶，等.血管内皮生长因子D 和血管内皮生长因子受体3 在人结肠癌中的表达及淋巴道转移中的作用.解剖学报，2007，38:56-60.

7 牟江洪，肖华亮，向德兵，等.VEGF-C 和VEGF-D 诱导结直肠癌癌周淋巴管生成.肿瘤，2006，26:815-818.

8 石艳华，叶红，关丽华，等.大肠正常粘膜、腺瘤及癌组织中VEGF 及其受体Flk-1 表达的意义.河北医药，2007，29:107-108.

9 White JD，Hewett PW，Kosuge D，et al.Vascular endothelial growth factor-D expression is an independent prognostic marker for survival in colorectal carcinoma.Cancer Res，2002，62:1669-1675.

10 赵阿红，尹玉慧，李惠翔，等.乳腺癌组织中VEGF、VEGF-D、VEGFR-3 表达与血管及淋巴管生成的相关性探讨.山东医药，2008，51:32-33.