参芪王浆养血口服液高效液相指纹图谱研究

祖 双，梁 洁，刘明颖，肖 雪

(1.吉林敖东延边药业股份有限公司，吉林 延边 133700；2.广东药学院，广东 广州 510006；3.广州白云山明兴制药有限公司，广东 广州 510250；4.中山大学南沙研究院， 广东 广州 511458)



参芪王浆养血口服液高效液相指纹图谱研究

祖 双1，梁 洁2*，刘明颖3，肖 雪2,4

(1.吉林敖东延边药业股份有限公司，吉林 延边 133700；2.广东药学院，广东 广州 510006；3.广州白云山明兴制药有限公司，广东 广州 510250；4.中山大学南沙研究院， 广东 广州 511458)

目的：采用高效液相色谱法建立参芪王浆养血口服液的指纹图谱，为其质量控制提供参考依据。方法：采用Agilent Zorbax-SB C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；乙腈-水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为203nm，流速1.0 mL/min。结果：建立参芪王浆养血口服液的HPLC指纹图谱，以13个共有峰作为参照峰；采用指纹图谱评价软件计算，相似度均≥0.85。结论：采用该法可为控制参芪王浆养血口服液的内在质量提供依据。

参芪王浆养血口服液；高效液相色谱法；指纹图谱

参芪王浆养血口服液(Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root)是由人参、黄芪、当归、蜂王浆等原料经现代生产工艺制成的制剂，主要功能为补益气血及养心安神，可用于治疗气血两虚证，症见神倦乏力、食欲不振、失眠等[1]。目前，参芪王浆养血口服液执行标准较低，难以有效表征产品的质量。与传统检测手段相比，中药指纹图谱是国际上公认的中药质量控制最有效的方法之一，可较为全面地反映多种成分的分布[2-4]。本试验对参芪王浆养血口服液进行HPLC分析，建立参芪王浆养血口服液的HPLC指纹图谱质量控制技术。

(责任编辑：尹晨茹)

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪(Agilent科技有限公司，美国，包括G13158 DAD检测器、G1312A低压四元泵，在线脱气机、自动进样器、柱温箱)；KQ-500E超声波清洗器(昆山超声设备有限公司)；Mill-Q Synthesis超纯水纯化系统(美国Millipore公司)；Excellence XP205型十万分子一分析天平(Mettler Toledo公司)；SL300N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2 试药

乙腈(色谱纯，Fisher公司)，甲酸(分析纯，北京现代东方精细化工有限公司)，超纯水自制。

参芪王浆养血口服液由吉林敖东延边药业股份有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent Zorbax-SB C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：采用梯度洗脱，A相为水，B相为乙腈；流速：1.0mL/min，DAD检测器，柱温35°C，检测波长为203 nm，进样量为5μL。洗脱程序见表1，得到的HPLC指纹图谱如图1所示，其中标记13个共有峰。

表1 参芪王浆养血口服液水提液洗脱程序

图1 参芪王浆养血口服液HPLC色谱

2.2 样品供试品制备

取参芪王浆养血口服液成品，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取批号为1210001参芪王浆养血口服液成品，按“2.2”项方法制备，按“2.1”项色谱条件，连续进样6次，记录指纹图谱，以4号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积稳定的RSD分别小于0.1%和3.0%，表明精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取批号为1210001参芪王浆养血口服液成品6支，按“2.2”项方法制备，按“2.1”项色谱条件，各进样测定1次，记录指纹图谱，以4号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积稳定的RSD分别小于0.1%和3.0%，表明重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取批号为1210001参芪王浆养血口服液成品，按“2.2”项方法制备，按“2.1”项色谱条件，于0、2、4、8、16、24 h分别进样测定，记录指纹图谱。以4号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积稳定的RSD分别小于2.0%和3.0%，表明样品溶液在24h内稳定。

2.4 参芪王浆养血口服液指纹图谱相似度研究[5-7]

分别精密量取多批供试品溶液各5μL，按“2.1”项色谱条件进样，记录指纹图谱，通过指纹图谱评价软件(中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2004A版)分析，以13个共有峰为参照峰。将实验数据导入指纹图谱相似度评价软件，经自动匹配，生成对照图谱。各样品与对照色谱图相比较，采用夹角余弦法计算相似度，进行整体相似度评价。通过相似度分析，发现批样品的相似度均在0.85以上，表明样品相似性良好。详见图2。

3 讨论

3.1 方法选择

按照国家药典委员会关于“中药注射液指纹图谱研究的技术要求(暂行)”通知，以HPLC梯度洗脱法对参芪王浆养血口服液进行指纹图谱研究，实验证明：该方法可操作性强、重复性好，可作为参芪王浆养血口服液指纹图谱的研究基础。

3.2 流动相及波长选择

采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反向柱，对甲醇-水、乙腈-水等体系进行考察，结果显示乙腈-水体系得到的色谱峰峰型及分离度较好；同时对样品进行DAD全波长扫描，发现203nm处色谱峰表达理想，甲醇再次存在末端吸收，梯度洗脱易造成基线漂移，因此本试验选择乙腈-水作为洗脱体系，同时选取203nm作为检测波长。

3.3 洗脱流速选择

本试验考察了不同温度下指纹图谱的分离度，研究发现25℃时指标峰分离度变差，30℃和40℃时基线漂移较为严重，而35℃时基线较为平稳，分离度也较好。同时本试验还考察了多个流速，其中流速为0.5mL/min和0.8mL/min时，色谱峰不能完全洗脱；流速为1.2mL/min时，各指标峰的保留时间变小，分离度降低；当流速为1.0mL/min时，分离度较高，峰行较窄。因此，确定以1.0mL/min为参芪王浆养血口服液指纹图谱的洗脱流速。

图2 参芪王浆养血口服液HPLC色谱

4 结论

通过该方法分析参芪王浆养血口服液，经指纹图谱相似度软件分析，相似度均在0.85以上，所建立方法的精密度、稳定性和重复性均符合指纹图谱研究的技术要求，为参芪王浆养血口服液及其制剂的质量控制提供了科学依据。根据该指纹图谱可对参芪王浆养血口服液进行HPLC-IT MS和HPLC-TOF MS分析，定性鉴别出参芪王浆养血口服液的多种成分，如人参皂苷等数十种成分，进一步完善参芪王浆养血口服液的研究，为参芪王浆养血口服液的深入研究提供了良好的基础。

[1] 金光日，洪海.参芪王浆养血口服液中10-羟基-2-癸烯酸(10-HAD)的含量测定[J].长春中医药大学学报，2007，23(5)：32-33

[2] 罗国安，梁琼麟，王义明.中药指纹图谱-质量控制与新药研发[M].北京：化学工业出版社，2009.

[3] 罗国安，王义明.中药指纹图谱的分类和发展[J].中国新药杂志，2002(11):46-51.

[4] 肖雪，罗国安，王义明，等.中药板蓝根高效液相色谱法指纹图谱研究[J].江西中医学院学报，2010，22(3)：67-69.

[5] 李福龙，罗娟敏，张文惠，等.桔梗药材指纹图谱研究[J].江西中医药，2014，45(3)：65-66.

[6] 罗娟敏，肖雪，梁琼麟，等.丹红注射液指纹图谱研究[J].中成药，2011，33(8)：1277-1290.

[7] 乔善磊.中药指纹图谱相似度评价研究[D].上海：第二军医大学，2004.

(责任编辑：李岚春)

Study on Fingerprints of Nourishing Oral Liquid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root by HPLC

Zu Shuang1, Liang Jie2, Liu Mingying3, Xiao Xue2,4*

(1. Jilin Aodong Medicine Industry Group Co. Ltd., Yanbian 133700,China;2. Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006,China;3. Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co.,Ltd.,Guangzhou 510250,China;4. Nansha Research Institute, Sun Yat-sen University, Guangzhou 511458,China)

Objective:To study the HPLC fingerprint and establish a sensitive and specific method for controlling the quality of Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root (NOLRJGA). Methods:HPLC method was set up using Agilent Zorbax-SB C18column(4.6mm×250mm, 5μm) with gradient elution, the mobile phase was comprised of acetonitrile and water, the UV detection wavelength was at 203nm, with a flow rate of 1.0mL/min. Results:The HPLC fingerprint was set up successfully, and the similarity were higher than 0.85 with a total of 13 peaks as reference peaks by similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM.Conclusion:The quality of NOLRJGA can be controlled effectively by HPLC fingerprints.

Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly；Ginseng and Astragalus Root;HPLC;Fingerprint

2014-09-11

祖双(1970-)，男，吉林敖东延边药业股份有限公司主管药师，研究方向为中药质量控制。E-mail：zushuang2008@126.com

梁洁(1969-)，女，硕士，广东药学院副教授，研究方向为功能食品与公共营养。E-mail：liangjie69@126.com

R284

A

1673-2197(2015)02-0019-03

10.11954/ytctyy.201502008