桑白皮化学拆分工艺及互不交叉性研究

2015-04-25王小兰张艳丽张明辉匡海学冯卫生郑晓珂

世界中医药 2015年12期

关键词：桑白皮组分乙醇

王小兰王绅赵威张艳丽张明辉匡海学冯卫生郑晓珂

(1 河南中医学院，郑州，450046；2 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省创新中心，郑州，450046；3 黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040)

桑白皮化学拆分工艺及互不交叉性研究

王小兰1,2王绅1,2赵威1,2张艳丽1,2张明辉1,2匡海学3冯卫生1,2郑晓珂1,2

(1 河南中医学院，郑州，450046；2 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省创新中心，郑州，450046；3 黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040)

目的:建立桑白皮全成分的拆分工艺，并对各拆分组分进行互不交叉性研究与工艺稳定性考察。方法：首先采用水煎、萃取、醇沉、大孔吸附树脂等技术建立桑白皮化学组分的拆分方法；然后运用HPLC-PDA、HPLC-ELSD色谱法与ChemPattern化学计量学软件相结合，采用主成分分析法与聚类分析法探讨各拆分组分是否有交叉。结果：桑白皮的全成分拆分为5个组分，将不同检测器的HPLC色谱数据结合化学计量学分析，结果显示各拆分组分互不交叉，该工艺所得10批次各拆分组分，通过HPLC-PDA特征图谱研究，进行相似度评价，工艺稳定。结论：本研究建立了稳定的桑白皮化学组分拆分工艺，该工艺稳定、重现性良好，各个拆分组分基本无化学成分交叉。

桑白皮化学拆分工艺；HPLC-PDA；HPLC-ELS；互不交叉性分析；化学计量学分析

中药性味理论是中药药性理论的核心，是几千年来中医临床用药的重要依据，近年来，随着中医药现代化研究发展，有关中药药性研究也日益增多，本研究首席科学家匡海学教授提出来“一药X味Y性(Y≤X)。中药性味的物质基础是可拆分性、可组合性”的中药性味理论研究新假说，遵循这一理论，本研究以桑白皮为研究对象，采用中药性味可拆分性的研究模式[1]，结合现代仪器分析技术，对桑白皮化学组分拆分工艺进行研究，并且应用ChemPattern软件对各拆分组分进行化学计量学分析，探讨各拆分组分互不交叉性与工艺的稳定性，为进行桑白皮性味药理评价奠定基础。

1 材料

1.1 药材所用桑白皮购自郑州市中药材市场，由河南中医学院陈随清教授鉴定为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮。

1.2 设备与试剂 Waters2695高效液相色谱仪，2998PDA检测器，Waters 2424ELSD检测器；BIOMATE3S型紫外分光光度计(美国热电)；Empower色谱数据工作站；ChemPattern化学计量学系统解决方案软件(科迈恩科技有限公司)；BT-25S型十万分之一电子天平(赛多利斯)；Arium 611 VF超级组合型超纯水器(SARTORIUS)，Q-250A3粉碎机；流水式抽气机(上海爱朗仪器有限公司)；SK2200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)；SB-1000型旋转蒸发器(上海爱朗仪器有限公司)；迪马PLATISIL(TM)ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；DiaionHP-20大孔吸附树脂(日本三菱公司)，甲醇(美国天地公司，色谱醇)；乙腈(美国天地公司，色谱醇)；95%乙醇(北京化工厂，分析纯)；水(超纯水)。

2 方法与结果

2.1 桑白皮各化学组分拆分工艺的研究桑白皮水煎液提取方法考察：影响传统中药汤剂质量的主要因素包括加水量、煎煮次数及煎煮时间等。因此本研究采用L9(33)正交实验考察上述3因素对桑白皮水煎煮提取率的影响，确定工艺为：10倍量水煎煮3次，每次1 h。

桑白皮全成分提取工艺建立：桑白皮1000 g，10倍量水煎煮3次，每次1 h，纱布过滤，合并滤液，浓缩干燥得桑白皮水煎液，提取率为17%。

桑白皮全成分拆分工艺建立：桑白皮水煎液减压浓缩，加其2倍量的石油醚萃取，上清液浓缩回收溶剂后真空干燥6 h，得石油醚组分(该组分为脂肪油拆分组分)，提取率为3.10%，其余水提液上DiaionHP-20柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇洗脱，得到桑白皮30%、50%、80%乙醇拆分组分，提取率分别为5.8%、0.31%、0.25%，其中，水洗脱部分经过醇沉得到多糖拆分组分，提取率分别为4.4%。

2.2 供试品溶液的制备精密称取桑白皮25 g，10倍量的水提取3次，提取时间为1 h，提取液经减压浓缩、离心、过滤，将所得滤液浓缩至干，加入流动相超声溶解，定容于50 mL容量瓶中，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 桑白皮水煎液色谱条件建立[2-5]色谱柱为迪马PLATISIL(TM)ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);以流动相甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脱，洗脱程序见表1，流速：1.0 mL/min，检测波长：280 nm。

2.4 方法学考察方法学考察中进行了精密度、稳定性的研究，结果表明仪器精密度符合要求，标准品在24 h内稳定，样品处理操作重现性良好，保证了实验结果的准确、可靠。

表1 桑白皮水煎液HPLC梯度洗脱条件

2.4.1 精密度试验取同一批桑白皮药材，按“2.2”项制备供试品溶液，按上述色谱条件各拆分组分分别连续进样6次，以考察仪器重现性。色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算保留时间及峰面积的RSD值。其RSD值均小于3%，表明色谱系统精密度良好。

2.4.2 稳定性试验取同一批桑白皮药材，按“2.2”项制备供试品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h测定HPLC色谱图，以考察24 h内的稳定性。色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算保留时间及峰面积的RSD值。RSD小于3%，表明样品在24 h内性质稳定。

2.5 桑白皮化学拆分组分互不交叉性研究根据2.1中拆分工艺得到的5个拆分组分，在建立了桑白皮水煎液HPLC色谱条件的基础上，本实验对各拆分组分的互不交叉性进行研究，在桑白皮的5个拆分组分中脂肪油组分、挥发油组分以及醇沉组分，因沸点与分子量差异较大，不存在与其他组分交叉，故本实验采用HPLC-PDA色谱法主要对桑白皮的30%乙醇、50%乙醇以及80%乙醇洗脱组分进行了初步互不交叉研究，为下一步深入研究奠定基础。

2.5.1 桑白皮水煎液HPLC-PDA色谱条件下的结果将“2.1”项下制备的各拆分组分样品，按确定的桑白皮水煎液HPLC色谱条件进行测定，并将各图谱进行叠加。根据出峰情况，可以看出，各拆分组分与水煎煮总提物相比基本上未出现成分缺失，基本实现了全成分拆分。从保留时间上可以观察到：30%乙醇洗脱组分集中在0—45 min，50%乙醇洗脱组分集中在35—65 min，80%乙醇洗脱组分集中在60 min以后。各拆分组分且峰值较高的成分从保留时间来看，基本上无重叠，提示个拆分组分成分基本无交叉，结果见图1。

2.5.2 采用不同流动相及检测器进一步确认各组分的互不交叉性中药成分非常复杂，为了进一步确认结果的准确与可靠，全面检测各拆分组分化学成分之间的互不交叉性，最终验证拆分工艺的成功，本研究首先分别建立了30%乙醇、50%乙醇以及80%乙醇洗脱组分的HPLC色谱条件，进而分别采用三种不同的色谱条件，在HPLC-PDA与HPLC-ELSD的检测器下，验证各拆分组分的互不交叉性。

图1 HPLC叠加图

注：A.水煎总提物，B.30%乙醇洗脱组分，C.50%乙醇洗脱组分，D.80%乙醇洗脱组分

2.5.2.1 桑白皮各拆分组分HPLC色谱条件的建立 1)HPLC-PDA色谱条件：色谱柱：PLATISIL(TM)ODS C185 μm，250 mm×4.6 mm；流动相梯度洗脱条件见表2；流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃；检测波长：280 nm。

2)蒸发光检测器(ELSD)：色谱柱：菲罗门Synergi Fusion-RP色谱柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)；流动相梯度洗脱程序见表2；流速：1 mL/min,；柱温：30 ℃；增益：10；数据率：10；漂移管温度：60 ℃；气体压力：40 psi；喷雾器模式为加热，其动力水平为36%。

表2 各拆分组分HPLC流动相梯度洗脱程序

2.5.2.2 采用HPLC-PDA色谱法对桑白皮各拆分组分互不交叉性研究分别以30%，50%，80%乙醇洗脱组分HPLC色谱条件验证各拆分组分的互不交叉性(见表2)。采用30%乙醇洗脱条件时，50%、80%乙醇洗脱组分在0—65 min之间基本无相应的色谱峰出现；在50%乙醇洗脱条件下分析，30%、80%乙醇洗脱组分在45—75 min之间基本无相应的色谱峰出现；采用80%乙醇洗脱条件时，30%、50%乙醇洗脱组分在34—65 min之间基本无相应的色谱峰出现。结果显示，采用PDA检测器，在不同的流动相下对3种拆分组分反复比对，结果显示采用不同的流动相各拆分组分保留时间基本无交叉，见图2-图4。