人脑星形细胞瘤中HIF－I a和COX－2的表达及与血管生成的关系①

姜 壮，刘劲睿，许高权

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003)

星形细胞瘤是神经外科常见的疾病，为浸润性生长肿瘤，多数肿瘤手术难以切除完全，且复发后肿瘤可演变成更高级别星形细胞瘤，预后较差。人们通过研究肿瘤分子生物学，逐渐认识到肿瘤的发生受多种因素影响，起到关键性作用的是肿瘤基因的激活和抑肿瘤基因的失活，并且有多种细胞因子参与。低氧诱导因子(hypoxia－inducible factor－1，HIF－1)是Semenza等人在1994年发现的［2］，对缺氧诱导基因表达有重要影响［1］，是一种异源二聚体转录因子，能够促进肿瘤血管的生长。环氧化酶－2(cyclooxygenase，COX－2)是生成前列腺素以及分解花生四烯酸的一种非常重要的限速酶，通过大量的研究，得知该限速酶可以有效推动肿瘤新生血管的形成和发展［4，5］。

1971年，在肿瘤界，提出了如下假设:以肿瘤血管形成为出发点，把肿瘤的形成和发展划分成为如下两个生长环节:一是血管生长环节;二是血管生长前期。在人的身体中，都是依靠血管来为全身组织提供营养，肿瘤的形成和发展也是如此［3］。如果血管不能够提供足够的营养，那么肿瘤就难以发生转移和生长。现阶段，对肿瘤血管进行有效抑制也成为治疗肿瘤的一种新途径。

本实验对人脑星形细胞瘤和正常脑组织表达检测，从分子水平来探讨星形细胞瘤和正常脑组织病理学分级的关系。本研究旨在明确星形细胞瘤中HIF－1α、COX－2表达变化以及它们与肿瘤微血管密度和临床病理特征的关系，分析了HIF－1α、COX－2在星形细胞瘤发生和发展的作用及它们的相互作用。为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本

将佳木斯大学附属第一医院神经外科和佳木斯市中心医院神经外科2012－02～2013－10手术切除标本51例为研究对象，其中16例颞顶叶及以颞顶叶为主，16例发生于额叶及以额叶为主，19例发生于其它部位。女31例，男20例，年龄7～67岁，病例均为原发病例，术前未行化疗和放疗。

1.2 方法

用福尔马林液固定一部分标本，制成蜡块，切成厚约4μm的连续切片3张做免疫组化染色。另一部分标本存放液氮罐内，在温度为的冰箱里保存。依据目前所执行的中枢神经系统肿瘤分类标准，对标本标准分级，处于Ⅰ级的有11例，Ⅱ级21例，Ⅲ级12例，Ⅳ级7例。低度恶性实验组为Ⅰ～Ⅱ级共32例，高度恶性实验组为Ⅲ～Ⅳ级共19例，对照组选择21例非瘤脑组织。非瘤脑组织标本取自脑外伤病人，处理方法同肿瘤标本一致。

1.3 试剂

1:30浓缩型鼠抗人HIF－1单克隆抗体，兔抗人COX－2单克隆抗体(即用型)。鼠抗人CD34单克隆抗体(即用型)。DAB试剂盒(三管装)。兔二步法检测试剂盒。鼠二步法检测试剂盒。

1.4 结果判定

HIF－1a和COX－2表达为阳性的现象一般都是胞核内有棕黄色细颗粒，每张切片在200倍显微镜下任意挑选五个视野，记录视野中胞核内有棕黄色细颗粒的细胞数和肿瘤细胞的总细胞数，以总细胞数中阳性细胞数所占比例作为判别的条件，小于为阴性;处于之间的为弱阳性;处于之间的为中度阳性;为强阳性;全部都被看为阳性表达。

微血管计数:使用单抗对血管内皮细胞进行标记，细胞呈现棕黄色，细胞膜染色比较深。微血管计数采用Weidner的方法计数。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析:计数资料主要采用χ2检验;计量资料采用t检验和方差分析。取P＜0.05为假设检验有统计学差异的标准。

2 结果

2.1 正常脑组织中含有的COX－2和HIF－1α要远远低于星形细胞瘤，这就意味着COX－2和HIF－1α在星形细胞瘤的浸润发展具有非常重要的作用。

2.2 对于星形细胞病理分析而言，COX－2和HIF－1α表达与其具有正相关性，如果他们分期越晚，那么意味着其表达程度越高。

2.3 COX－2和HIF－1α的表达同 MVD呈现出正相关关系，在星形细胞瘤中可以促进血管的形成。

表1 在星形细胞瘤和非瘤脑组织中COX－2蛋白的表达

表2 在星形细胞瘤和非瘤脑组织中HIF－1α蛋白的表达

表3 MVD星形细胞瘤与非瘤脑组织中的表达

表4 HIF－1α.COX－2与MVD之间在星形细胞瘤中的关系

表5 HIF－1α与COX－2的表达在星形细胞瘤中的关系(R=0.465，P ＜ 0.05)

3 讨论

3.1 星形细胞瘤是浸润生长性肿瘤，容易复发，预后不良。传统的治疗是以手术为主，术后结合放化疗等综合治疗，即使如此也不能完全避免肿瘤的复发，而且复发的星形细胞瘤恶性度常常会升高。随着分子生物学的发展，基因治疗和免疫治疗给彻底治愈脑星形细胞瘤带来了希望［6］。恶性肿瘤内部普遍存在缺氧的现象，缺氧可以诱导肿瘤细胞中HIF－1α表达。本实验免疫组化检测，HIF－1α蛋白在星形细胞瘤中为54.9%的阳性率，在Ⅲ～Ⅳ级星形细胞瘤几乎均表达(阳性率为84.2%)，高于在Ⅰ～Ⅱ级星形细胞瘤中的表达(Ⅰ级阳性率为27.3%，Ⅱ级阳性率为42.9%)。在非瘤脑组织中HIF－1α蛋白为阴性表达。表明HIF－1α的表达程度与星形细胞瘤的病理分级呈正相关。机理可能是星形细胞瘤病理级别越高，肿瘤生长和侵袭的速度越快，则相应的缺氧更加严重。

3.2 星形细胞瘤组织中 COX－2蛋白表达占58.8%，在细胞质和细胞核中都有表达，显著高于正常脑组织(14.3%)。提示COX－2表达升高可能与星形细胞瘤的发生和发展有关。这与杜继臣教授等学者对胶质瘤进行研究的结果相同［7，8］。在研究中我们还观察到，COX－2的含量水平与星形细胞瘤的病理级别有关。高级别的星形细胞瘤中COX－2的阳性表达率为89.5%，而在低级别的星形细胞瘤中的表达率为40.6%。两者之间有显著差异性(P＜0.05)，可见星形细胞瘤组织中COX－2随病理级别的增加阳性率表达增加，提示COX－2的表达水平可能与肿瘤细胞的增殖密切相关。不表达见于正常脑组织，而弱表达见于低级别肿瘤组织，说明COX－2随着星形细胞瘤级别的升高而逐步递增。从病理学角度来讲COX－2的过高表达，可导致细胞的过度增殖，并抑制细胞的分化诱导和凋亡。在具有COX－2表达的肿瘤细胞中，COX－2可导致前列腺素产生及诱导血管内皮生长因子等血管新生因子，促使肿瘤的产生和肿瘤血管的新生，从而促进肿瘤的增殖和发展。

3.3 本实验结果表明HIF－1α与COX－2在星形细胞瘤中的表达成正相关，且MVD在HIF－1α与COX－2均为阳性表达的星形细胞瘤组织中的值明显高于在两者均为阴性或其中任一项为阴性表达的值，提示在肿瘤血管形成过程中HIF－1α与COX－2之间存在一定的关联。可能存在协同作用。由于HIF－1α、COX－2之间存在复杂的相互调控机制，因此也没有办法分析出两者中哪一种对肿瘤血管的生成更具作用。因此，设计能够对这两者都其作用的抑制剂比只针对一种有效的抑制剂会更加有用，这是一种更为宽广的研究思路。

［1］ZpllosA.Mitoehondria D －loop sequences are integrated in the rat nuclear genome［J］.J Mo Bi0 ，1991，211(2):12-23

［2］Semenza GL，Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcripitional activation［J］.Mol Cell Biol，1992，12(12):5447-5454

［3］Folkman J.Angiogenesis［J］.Annu Rev Med，2006，57:1-18

［4］PairedM，Engelhard G.Distinetisforms(COX －landCOX －2)of cyclooxyge－nase:possible physiological and therapeutic implications［J］.Fandom Cline Pharmacology，1996，10(1):I-I7

［5］DuBois RN，Awad J，MorrowJ，et al.Regulation ofeieosanoid produetion and Mitogenesis in rat intestinal epithelial cells by transforming growth faetor－ a and Phothol ester［J］.JCIin.Investig，1994，93(2):493-498

［6］印健，赵三虎.胶质瘤中HIF－1a的表达及其增殖指标ki67的关系［J］.黑龙江医药科学，2006，29(2):11

［7］杜继臣，吴宇明等脑胶质细胞瘤VEGF，COX－2基因蛋白表达及临床意义中国误诊学杂志，2003，3(10):1460-1463

［8］廉晓宇，李显伟，李英夫.揽香烯和VEGF多克隆抗体联合应用对C6胶质瘤增殖抑制作用的研究［J］，黑龙江医药科学，2009，32(1):17