BMP 活性多肽复合羟基磷灰石聚乳酸在大鼠体内异位成骨的实验研究

王硕 谢惠敏 甘少磊 任卫卫 陈秉耀 张增亮 韦兴

我国人口众多，由于各种原因，如创伤、肿瘤、先天因素等导致的大块骨缺损，影响着人们的基本生活及美观。在临床工作中，自体骨移植材料以几乎零成本、高效的骨诱导、骨传导及成骨能力，成为优选材料。然而由于它固有的缺点：供区有限、供区并发症等问题明显[1-2]，人们一直在寻找一种能替代自体骨植骨材料的人工材料。但是很多骨科移植物都缺乏内在的骨诱导性能，从而不能刺激未分化的多能干细胞向成骨细胞方向发展。骨形态发生蛋白 ( bone morphogenetic proteins，BMP )的出现弥补了这一点，它成为了最广泛的骨形成调控因子[3]。美国食品和药物管理局 ( Food and drug administration，FDA ) 已批准进入临床的 BMP 类产品有 InFUSE Bone Graft ( rhBMP-2 与牛 1 型胶原复合 )和 OP.1 Putty ( rhBMP-7 与牛胶原复合 )，它们的临床应用结果表明，具有很好的促进成骨作用[4]。

然而，它们由于制备工艺复杂、生产周期长、产率低、价格昂贵等现实问题不能被中国大多数患者所接受[5]。本课题组利用 BMP-2 氨基酸序列中诱导成骨的核心功能区，应用固相多肽合成法合成不同组合的 BMPs 序列多肽，该多肽保留了 BMP-2 的骨诱导能力，且无免疫原性等优点，该方法具备合成费用低的特点。本研究拟通过 SD 大鼠异位成骨实验进一步验证哪种组合的 BMPs 序列多肽具有较好的诱导成骨作用，为该材料的临床应用，提供实验基础。

材料与方法

一、材料

1. 实验动物及实验材料制备：SD 大鼠，雄性，8 周龄，200～250 g / 只，共 48 只，由解放军总医院第一附属医院实验动物中心提供。

制备好的框架材料羟基磷灰石聚乳酸 ( hydroxyapatite and poly lactic acid，HA / PLA ) 参数如下：空隙率 80%，平均孔径 120 m，表观密度 0.74 g / cm，压缩强度 1 MPa。无菌条件下将框架材料切成直径4 mm / 厚约 1.5 mm 的圆片，用60Co照射 ( 2.5 Mrad )消毒。并将 BMP 活性多肽用双蒸水溶解，将消毒后的材料浸泡在多肽溶液中 18 h，待多肽溶液完全进入材料后取出密封，置于 4 ℃ 保存。本次实验拟对 BMPIII 与 BMPIV 两种 BMP 活性多肽复合HA / PLA 进行检侧，并将每种材料复合多肽的剂量分为 3 种，分别 0.2 g / L、0.4 g / L、0.8 g / L。实验材料由北京博恩康生物科技有限公司提供，应用固相法合成。

多肽序列：BMPI：KIPKASSVPTEL，专利号 2014101217256；BMPIII：SVPTELSAISTLYL、BMPIV：KIPKASSVPTELSAISTL，专利号：2014101224353。

2. 主要试剂：戊巴比妥钠购自美国 Sigma 公司；伊红购自北京化学试剂公司；苏木素购自北京化学试剂公司；改良 Masson 三色染色试剂盒购自Leagene 公司。

3. 主要设备：手术器械购自江苏三兴医疗器械公司；显微镜及码成像系统 ( Olympus BX50、DP50 )。

二、方法

1. 实验动物分组及手术方法：应用随机抽签法将 48 只 SD 大鼠随机分为 8 组 ( A、B、C、D、E、F、G、H 组 )，每组 6 只。8 周龄，200～250 g /只：将 BMPIII 多肽的 3 种浓度 0.2 g / L、0.4 g / L、0.8 g / L 的分别与 HA / PLA 组成的复合材料植入大鼠体内，分别为 A、B、C 组；将 BMPIV 多肽的 3 种浓度 0.2 g / L、0.4 g / L、0.8 g / L 分别与 HA / PLA 复合植入大鼠体内，分别为 D、E、F 组；植入 0.4 g / L浓度 BMPI 多肽与 HA / PLA 组成的复合材料的实验对照为 G 组，仅植入 HA / PLA 框架材料的空白对照为 H 组。

用与 SD 大鼠质量百分比为 3% 的戊巴比妥钠溶液静脉麻醉后，无菌操作下，充分暴露两侧臀部肌肉，用手术刀切开臀部肌肉浅层，将材料放入并用不可吸收丝线将伤口缝合。按照实验分组，术后自由活动，分笼饲养。

2. 观察指标：( 1 ) 观察术后 SD 大鼠活动、进食、伤口愈合等一般情况。( 2 ) 术后 3、5 周时分别对各组随机选取 3 只大鼠麻醉进行影像学检查，并于检测后在麻醉状态下注入空气处死并提取材料标本。术后 3 周摄背部正位 X 线片；术后 5 周时进行 X 线、CT 照射。( 3 ) 将各组不同时间段的取材标本用 10% 甲醛溶液固定 24 h，硝酸脱钙 12 h 后，常规石蜡包埋，经切片、HE 染色后在光学显微镜下观察组织形态。( 4 ) Masson 染色组织学观察新生骨胶原形成 ( 蓝色 ) 并计算新生骨面积[6]。由于Masson 染色对新生骨基质、植入材料及周围正常组织显色层次感明显，可以显著区分胶原和其余组织，故应用 Masson 染色对材料组织进行数据分析，以明确材料周围软骨基质分泌及成骨情况[6-7]。应用电子显微镜在每个标本材料区域内随机提取 3 个视野 ( ×400 )，计算成骨 ( 胶原 ) 面积。采用 Masson染色成骨面积评分系统进一步对各组在成骨胶原分泌旺盛时 ( 术后 5 周 ) 骨诱导活性进行组织学评分，并将其评分结果进行秩和平均等级两两比较[8]。未见胶原组织为 0 分，～25% 为 1 分，～50% 为2 分，～75% 为 3 分，～100% 为 4 分，统计并得出结果。

三、统计学处理

应用 SPSS 16.0 软件进行统计学分析。多组数据之间比较采用等级资料的秩和检验分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、实验动物一般情况及大体观察

所有动物均顺利完成手术。术后观察期间，动物饮食、活动良好，各组实验动物伤口无肿胀、无脓性渗出、愈合良好，动物全部存活。植入材料各组硬度均增加。

二、X 线及 CT 成像观察结果

X 线检查：术后 3 周，手术植入区 A、B、D、E、G 组均有轻度模糊显影，C、F 组显影明显，H 组未见明显显影；术后 5 周，A、D 组植入区内有较浅显影，B、E、G 组有较浅较大显影，C、F 组显影较明显，H 组未见明显显影 ( 图 1～3 )。

图1 a～c：分别为 A、B、C 组术后 3 周的 X 线显像；d～f：分别为 A、B、C 组术后 5 周的 X 线显像 (显示可疑或可见材料成骨 )图2 a～c：分别为 D、E、F 组术后 3 周的 X 线显像；d～f：分别为 D、E、F 组术后 5 周的 X 线显像 (显示可疑或可见材料成骨 )图3 a：为 G 组术后 3 周 X 线显像；b：为 G 组术后 5 周 X 线显像；c：为 H 组术后 5 周 X 线显像；d：为 H 组术后 3 周 X 线显像(显示可疑或可见材料成骨 )Fig.1 a-c: The X-ray films at 3 weeks after the operation in group A, B and C; d-f: The X-ray films at 5 weeks after the operation in group A, B and C. The suspicious or visible osteogenesis material was showed by theFig.2 a-c: The X-ray films at 3 weeks after the operation in group D, E and F; d-f: The X-ray films at 5 weeks after the operation in group D, E and F. The suspicious or visible osteogenesis material was showed by theFig.3 a: The X-ray film at 3 weeks after the operation in group G; b: The X-ray film at 5 weeks after the operation in group G; c: The X-ray film at 5 weeks after the operation in group H; d: The X-ray film at 3 weeks after the operation in group H. The suspicious or visible osteogenesis material was showed by the

CT 显示：除 A、D 组可见较模糊低密度显影外，B、C、E、F、G 组均显影明显，H 组未见显影。为排除框架材料 HA / PLA 未分解的材料对影像学影响，将框架材料在体外与大鼠尾骨做对比进行CT 照射，骨窗下仅见极低密度显影 ( 图 4～5 )。

三、组织学切片观察结果

1. HE 染色：A、B、C、D、E 及 F 组术后 3 周可见少量成骨细胞长入多孔材料，贴附于孔壁；随着植入时间的延长，材料周围软骨细胞活跃，材料逐渐降解，术后 5 周材料部分降解，其中 B、C 组有较多软骨基质形成，D、E、F 组分泌软骨基质情况与相对应的 A、B、C 组大致相同。G 组术后 5 周材料也降解，软骨基质形成较多，有较多软骨细胞形成；H 组框架材料分解较少，软骨基质形成极少( 图 6～8 )。

2. Masson 染色及术后 5 周成骨量评分比较：术后 3 周，A、D 组在降解材料周围仅有少量软骨胶原形成表现为蓝色，且 B、C 组和 E、F 组软骨胶原量分别明显多于 A 组和 D 组，表现为蓝色，可见少许红染。G 组术后 3 周蓝色面积较小，而 H 组降解材料周围软骨胶原极少。术后 5 周，A、B、C、D、E 及 F 组蓝色面积明显多于术后 3 周，周围少量红染，G 组蓝色面明显增大，而 H 组降解材料周围软骨胶原较少，仅见少量蓝色软骨胶原形成( 图 9～11 )。

成软骨胶原面积的 Masson 评分：B 组 ( 2.22±0.45 ) 分、C 组 ( 2.44±0.35 ) 分明显大于 A 组 ( 1.06±0.39 ) 分，E 组 ( 2.28±0.25 ) 分、F 组 ( 2.44±0.35 ) 分明显大于 D 组 ( 0.72±0.25 ) 分，差异有统计学意义(P＜0.05 )；A 组与 D 组的评分相差不大 (P＞0.05 )，而 E、F 组评分均明显大于 A 组，B、C 组评分均明显大于 D 组，差异有统计学意义 (P＜0.05 )；B、C、E、F 组各组间评分两两比较，差异均无统计学意义(P＞0.05 )；G 组评分 ( 2.67±0.30 ) 分较 B、E 组大，差异均有统计学意义 (P＜0.05 )，而与 C、F 组评分相差不大 (P＞0.05 )。H 组评分最少，为 ( 0.222±0.27 ) 分，除 D 组外，与其它各组差异均有统计学意义 (P＜0.05 )。

图4 a～c：为 A、B、C 组术后 5 周的 CT 显像；d～f：为D、E、F 组术后 5 周的 CT 显像(显示可疑或可见材料成骨 )图 5 a：为框架材料 HA / PLA在体外以鼠尾为对照的 CT 横断面显像；b：为 G 组术后 5 周的CT 显像；c：为 H 组术后 5 周的 CT 显像 (显示可疑或可见材料成骨 )Fig.4 a-c: The CT images at 5 weeks after the operation in group A, B and C; d-f: The CT images at 5 weeks after the operation in group D, E and F. The suspicious or visible osteogenesis material was showed by theFig.5 a: The framework materials HA / PLA were showed in the rat tail in vitro on CT; b:The CT image at 5 weeks after the operation in group G; c:The CT image at 5 weeks after the operation in group H. The suspicious or visible osteogenesis material was showed by the

图6 a～c：分别为术后 3 周 A、B、C 组的 HE 染色；d～f：分别为术后 5 周 A、B、C 组的 HE 染色 (为框架材料， 为软骨基质。图片均为光镜下 × 400，右下角比例尺长度 = 100 μm )图 7 a～c：分别为术后 3 周 D、E、F 组的 HE 染色；d～f：分别为术后 5 周 D、E、F 组的 HE 染色 (为框架材料， 为软骨基质。图片均为光镜下 × 400，右下角比例尺长度 = 100 μm )Fig.6 a-c: The HE staining at 3 weeks after the operation in group A, B and C; d-f: The HE staining at 5 weeks after the operation in group A, B and C. The framework material was marked by theand cartilage matrix was marked by the. Images were observed under the light microscope( ×400 ), and scale bar=100 μmFig.7 a-c: The HE staining at 3 weeks after the operation in group D, E and F; d-f: The HE staining at 5 weeks after the operation in group D, E and F. The framework material was marked by theand cartilage matrix was marked by the. Images were observed under the light microscope( ×400 ), and scale bar=100 μm

图 8 a：为术后 3 周 G 组的 HE 染色；b：为术后 5 周 G 组的 HE 染色；c：为术后 5 周 H 组的 HE 染色；d：为 H 组术后 3 周 HE 染色(为框架材料， 为软骨基质。图片均为光镜下 × 400，右下角比例尺长度 = 100 μm )图 9 a～c：分别为术后 3 周 A、B、C 组的 Masson 染色；d～f：分别为术后 5 周 A、B、C 组的 Masson 染色 (为框架材料， 为软骨基质。图片均为光镜下 × 400，右下角比例尺长度 = 100 μm )图 10 a～c：分别为术后 3 周 D、E、F 组的 Masson 染色；d～f：分别为术后 5 周 D、E、F 组 Masson 染色 (为框架材料， 为软骨基质。图片均为光镜下 × 400，右下角比例尺长度 = 100 μm )图 11 a：为术后 3 周 G 组 Masson 染色；b：为术后 5 周 G 组 Masson 染色；c：为术后 5 周 H 组 Masson 染色；d：为 H 组术后 3 周Masson 染色 (为框架材料， 为软骨基质。图片均为光镜下 × 400，右下角比例尺长度 = 100 μm )Fig.8 a: The HE staining at 3 weeks after the operation in group G; b: The HE staining at 5 weeks after the operation in group G; c: The HE staining at 5 weeks after the operation in group H; d: The HE staining at 3 weeks after the operation in group H. The framework material was marked by theand cartilage matrix was marked by the. Images were observed under the light microscope ( ×400 ), and scale bar=100 μmFig.9 a-c: The Masson staining at 3 weeks after the operation in group A, B and C; d-f: The Masson staining at 5 weeks after the operation in group A, B and C. The framework material was marked by theand cartilage matrix was marked by the. Images were observed under the light microscope ( ×400 ), and scale bar=100 μmFig.10 a-c: The Masson staining at 3 weeks after the operation in group D, E and F; d-f: The Masson staining at 5 weeks after the operation in group D, E and F. The framework material was marked by theand cartilage matrix was marked by the. Images were observed under the light microscope ( ×400 ), and scale bar=100 μmFig.11 a: The Masson staining at 3 weeks after the operation in group G; b: The Masson staining at 5 weeks after the operation in group G; c:The Masson staining at 5 weeks after the operation in group H; d: The Masson staining at 3 weeks after the operation in group H. The framework material was marked by theand cartilage matrix was marked by the. Images were observed under the light microscope ( ×400 ), and scale bar=100 μm

讨 论

一、BMP 多肽活性

骨形成发生蛋白 ( BMPs ) 是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白，属于转化生长因子 B 超家族成员，是一种多功能的细胞生长因子，能够在体内外诱导骨和软骨形成，是目前骨移植材料中，效果较理想的材料[9]。自 Urist 于 1965 年发现BMPs[10]，BMPs 已经被逐渐认识，并应用重组技术大量用于生产，rhBMP-2 与 rhBMP-7 是现在两个仅有的应用于国外临床的材料[11-12]。这两个材料已经过动物实验及临床实验，证明了它们有效的骨诱导活性，成为可以替代自体骨的移植材料[13]。尽管这两种材料有强大的骨诱导能力，但由于其制备工艺复杂、生产周期长、产率低、价格昂贵及术后局部炎性反应等问题，阻碍了其在临床的迅速发展[14-16]。根据 BMP-2 氨基酸序列中 II 型受体具有很多抗原表位，其特征性的“指节抗原表位”具有诱导成骨的核心功能区段 ( 20 个氨基酸 )[17]，通过 FMOC 固相多肽合成法合成含 20 多个氨基酸的寡肽－BMP 活性多肽 ( BMPI、BMPIII、BMPIV )，以便能够模拟天然骨基质的促发及指导生物矿化，在局部形成偏酸环境，促进局部钙磷自组装沉积到体内局部组织中胶原纤维表面，生长成按同一方向排列的坚硬羟基磷灰石微型晶体结构，形成与天然骨极为相似的结构。

固相合成的优点主要表现在，最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离，能够有效克服用基因工程技术制备大分子蛋白质时工艺复杂、成本高、价格昂贵的缺点；而且活性多肽可发挥与其蛋白质类似的作用，同时短链多肽活性位点能充分暴露并与细胞表面相应的受体结合，达到较好的生物活性。Saito 等曾将 BMP-2核心区的 20 个氨基酸复合藻酸盐水凝胶进行异位成骨实验，发现其效果不如 BMP-2，但优于对照组，在后期实验中对多肽进行改进，可于 12 周完成骨缺损修复[18-19]。Park 等[20]用包含促成骨活性区域 ( osteopromotive domain，OPD ) 的“DWIVA”序列的具有受体结合能力的 BMP-2 肽段进行骨缺损实验，在 4 周时有明显的骨质生长。Zhao 等[21]利用 BMP-2 多肽复合可注射水凝胶植入大鼠背部肌肉，注射后 6 周 HE 染色可见骨小梁形成，也证明BMP-2 多肽有骨诱导能力。

二、BMP 多肽实验结果分析

本课题组以往相关研究证实了，BMP-2 活性多肽具有体外定向诱导大鼠 BMSCs 向成骨方向分化的作用[22]。BMP 活性多肽与 BMP 一样具有生物学活性，有优秀的骨诱导能力[23]，但 BMP 活性多肽缺乏力学强度，且难于塑形。由于 HA / PLA 作为易于塑形且具有适当的力学性能，而缺乏骨诱导活性的材料。因此，将二者结合，希望能达到理想的植骨材料水平。为了评价 BMP-2 活性多肽复合 HA / PLA框架架材料在体内的活性，本研究根据在核心功能区两侧添加的氨基酸序列不同分为两个实验组，并与前期实验结果提示的骨诱导能力较优者 ( 0.4 g / L BMPI ) 进行对比，进行了异位成骨实验，将负载了BMPIII、BMPIV 的 3 个浓度 0.2 g / L、0.4 g / L、0.8 g / L活性多肽的框架材料。结果显示：术后 3 周，实验组 0.8 g / L 浓度组可见片状高密度影，而 0.2 g / L、0.4 g / L 浓度组可见轻微的点状低密度影；术后 5 周，0.4 g / L、0.8 g / L 浓度组均有新骨形成，片状高密度影明显增强，接近正常骨组织密度，而 0.2 g / L 浓度组新骨形成量较小，点状高密度影较浅。为排除框架材料 HA / PLA 对影像学影响，将框架材料在体外与大鼠尾骨做对比进行 CT 照射，骨窗下可见极低密度显影，基本不影响材料在影像学的观察。组织学观察可见，G 组与实验组 0.8 g / L 浓度组有大量骨胶原形成，可证明其骨组织增长旺盛。而实验组的0.2 g / L、0.4 g / L 浓度组骨胶原可见梯度增加，这说明 BMPIII 与 BMPIV 材料在 0.2～0.4 g / L 范围内骨胶原分泌会随浓度的增加而增加；而 0.4～0.8 g / L时，却无明显骨胶原分泌增加。以上研究结果表明，BMPIII 与 BMPIV 均有骨诱导活性，且两者等浓度时骨诱导活性大致相等 (P＞0.05 )；G 与 C、F 组骨诱导能力大致相等 (P＞0.05 )，均强于 BMPIII、BMPIV 其它浓度 (P＜0.05 )，可以证明浓度为BMPIII 与 BMPIV 的 0.8 g / L 组更适于成为骨修复材料，而 G 组 ( BMPI 0.4 g / L ) 骨诱导能力又较 BMPIII与 BMPIV 更适于成为骨诱导材料。

三、实验不足

本研究证明了术后 5 周各组有成骨，实验多肽具有骨诱导能力，但其效果距离 InFUSE Bone Graft( rhBMP-2 与牛 1 型胶原复合 )、OP.1 Putty ( rhBMP-7与牛胶原复合 ) 仍有不小距离[17-18]。有文献报道这些材料可以在术后 3～4 周局部有新生骨形成，本实验证明人工多肽在术后 5 周还处于骨胶原大量分泌期，故仍须将材料进一步改良。骨诱导实验只是材料动物实验的一部分，仍须进一步行动物体内骨缺损材料植入实验来验证其成骨能力、生物力学等性能。

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