大柴胡汤对豚鼠胆囊黏蛋白分泌及其基因表达的影响*

★ 陈小菁 胡晓晴 许亚超 韦宇峰 郑志祥 杨军平 张元 (．江西中医药大学附属医院普外科 南昌0006;．江西中医药大学护理学院 南昌000;．江西中医药大学0级硕士研究生 南昌0006;．江西中医药大学附属医院检验科 南昌0006)

胆石病的发病原因至今仍未完全阐明。现已证实，胆汁成分的改变，致石胆汁的形成，是胆石病产生与发展的重要因素，目前发现的促成致石胆汁的核蛋白包括免疫球蛋白、黏蛋白等［1－2］。在胆石形成中，大量的黏蛋白分泌，增高了致石胆汁的黏滞度，有利于胆石的形成。可见，有效的降低胆汁中黏蛋白的含量，逆转致石性病理胆汁是预防胆石生成及胆石复发的关键［3］。中医药是通过多靶点、多环节、多途径来发挥防治胆石病的作用。本研究通过随机对照动物实验，探讨大柴胡汤对豚鼠胆囊壁黏膜细胞分泌黏蛋白、胆固醇及胆汁酸的影响，以及是否调节黏蛋白基因的表达。

1 材料与方法

1．1 药品 大柴胡汤(柴胡15g、黄芩9g、芍药9g、半夏9g、生姜15g、枳实9g、大枣5枚、大黄6g)，常规水煎，分别浓缩成含生药量0．6g/mL、1．2g/mL、2．4g/mL三种剂量，4℃冰箱保存备用。熊去氧胆酸片，上海中西三维药业有限公司生产，批号:H37020552;胆固醇，1kg/袋，南昌赛尔(长城生物)有限公司生产，批号:20150118;鱼肝油，500mL/瓶，厦门星鲨药业集团生产，批号:闽饲预字(2010)035015;总胆固醇试剂盒，上海科华东菱诊断用品有限公司生产，批号:20150213;Rat TBA Elisa Kit，美国进口，批号:201503;生理盐水，河南太龙药业股份有限公司生产，批号:1105045。

1．2 动物 健康SPF级雄性豚鼠60只，体重180～220g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号:SCXK(湘)2011－0003。

1．3 仪器 DY89－1型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司生产;可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司生产;TGL－16G高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂生产;BIO－RAD－680型酶标仪，美国BIO－RAD公司生产;BTS－100型全自动生化仪，淄博恒拓分析仪器有限公司生产;UV1000型紫外/可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司生产;罗氏P80全自动生化分析仪，上海政翔化学试剂研究所生产;Genelight2400 PCR仪器，厦门安普利生物工程有限公司生产。

1．4 实验方法

1．4．1 造模 本实验根据周文江等在中国实验动物学杂志上发表的制造豚鼠胆囊结石模型的方法建立豚鼠胆固醇结石模型［4］:取豚鼠60只随机分成6组(空白对照组、模型组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组、熊去氧胆酸组)，取其中5组予成石饲料(普通饲料中添加1．2%胆固醇、5%蔗糖、3．5%鱼肝油)饲喂80天，正常组予普通饲料喂养。

1．4．2 给药 造模后，对照组及模型组予正常饲料加生理盐水灌胃喂养8周，其他4组分别予中药大柴胡汤按低剂量(6g/(kg·d))、中剂量(12g/(kg·d))、高剂量(24g/(kg·d))，熊去氧胆酸(10g/(kg·d))灌胃加正常饲料喂养8周。

1．4．3 标本采集与检测 8周后分批处死豚鼠，动物处死前24h禁食禁水，予3%戊巴比妥钠0.15mL/100g腹腔注射麻醉豚鼠，将豚鼠仰位固定于手术板，腹部剪毛后沿腹白线(腹正中线)剖开腹腔，寻找到胆囊，仔细抽吸胆汁，肉眼观察有无结石，然后切除胆囊并剖开，再次观察有无结石形成并作记录。在无菌操作下仔细刮除黏膜后，将胆囊标本放置于冻存管，于液氮中低温保存。胆汁中总胆汁酸(TBA)含量采用酶联免疫分析(ELISA)测定;胆汁中黏蛋白浓度采用磷钨酸沉淀－酚试剂法测定;胆固醇采用酶比色法测定，全自动生化仪检测;胆囊壁组织用苏木精－伊红病理染色，光镜下观察;胆囊黏蛋白基因表达情况采用RT－PCR方法进行研究观察。

1．5 统计学处理 数据分析用SPSS19．0统计软件包进行数据资料的统计学处理，计量资料用¯x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，方差检验齐者用最小显著差数(LSD)法，方差不齐者用Games－Howell法检验。

2 结果

2．1 大柴胡汤对豚鼠胆汁中黏蛋白浓度的影响结果见表1。模型组豚鼠胆汁中黏蛋白浓度明显高于空白组，中药组黏蛋白浓度明显低于熊去氧胆酸组，熊去氧胆酸组黏蛋白浓度较模型组明显降低(P＜0．05)。

表1 大柴胡汤对豚鼠胆汁中黏蛋白的影响(¯x±s，n=10)

2．2 大柴胡汤对豚鼠结石及胆汁分泌量的影响结果见表2。大柴胡汤能溶、排胆囊胆固醇结石，且低剂量效果较佳;低剂量大柴胡汤可明显促进胆汁分泌，中、高剂量大柴胡汤对胆汁分泌的促进作用相对较弱。

表2 大柴胡汤对豚鼠结石、胆汁分泌量的影响(n=10)

2．3 大柴胡汤对豚鼠胆汁中胆固醇、胆汁酸含量的影响 结果见表3。与模型组相比，低剂量、中剂量大柴胡汤组和熊去氧胆酸片组豚鼠胆汁中胆汁酸含量较高(P＜0．01);在各组中，低剂量大柴胡汤组豚鼠胆汁中胆汁酸含量最高(P＜0．05)，中剂量及高剂量大柴胡汤组则相对较高;低剂量大柴胡汤组豚鼠胆汁中胆固醇含量最低(P＜0．01)。

表3 大柴胡汤对豚鼠胆汁中胆固醇、胆汁酸含量的影响(x¯±s，n=10)

表4 大柴胡汤对豚鼠胆囊黏蛋白基因表达的影响(¯x±s，n=10)

2．4 大柴胡汤对豚鼠胆囊壁组织的病理改变 光镜下，正常组胆囊黏膜上皮细胞呈单层柱状排列，黏膜皱壁完整。模型组胆囊部分被复腺上皮脱落或增生，黏膜间质水肿、充血、炎细胞浸润，而观察组、对照组的上述病变较轻。

2．5 大柴胡汤对豚鼠胆囊蛋白基因表达的影响结果见表4。与模型组相比，低剂量、中剂量、高剂量大柴胡汤组和熊去氧胆酸片组豚鼠胆囊黏蛋白基因MUC3表达明显较低(P＜0．01)，高剂量大柴胡汤组和熊去氧胆酸片组豚鼠胆囊黏蛋白基因MUC1、MUC2表达明显偏低(P＜0．01);低剂量、中剂量大柴胡汤组豚鼠胆囊黏蛋白基因MUC1、MUC2表达较低(P＜0．05)。

3 讨论

中医学认为，胆石病和胆囊炎均为由气及血，肝胆气郁与胆汁壅阻、痰瘀互结互为因果，使得结石不断增大，炎症反复不愈，不断损伤肝胆功能，形成了恶性循环，最终湿热越聚越重衍生百病［5］。中医认为，“按之心下满痛者，此为实也，当下之，宜大柴胡汤”。大柴胡汤中柴胡、枳实、黄芩具有清利郁热、疏肝利胆的功效;甘草坐镇中州，合白芍酸甘化阴，既可以缓和泻下药物伤阴，同时防止邪热入里伤阴。从现代药理学分析，大黄内的大黄素能有效地解除乙酰胆碱导致的痉挛，有松弛括约肌、加强胆囊收缩、胆管扩张，促进胆汁的排泄，驱除胆道异物且有抗菌作用;柴胡可以增加胆固醇－胆盐系数，具有极强的利胆功能;白芍可以松弛肌肉，有助于胆汁排泄并具备镇痛作用［6－7］。

当胆汁中胆汁酸含量低而胆固醇含量高时，易形成胆固醇结晶。模型组的总胆汁酸较正常组明显低，而胆固醇、黏蛋白含量则较高。观察组能升高总胆汁酸浓度，降低胆固醇、黏蛋白含量，且作用明显优于对照组。黏蛋白可作为胆石基质网络胆固醇结晶，或作为成核因子促使胆石形成，其浓度过高，还会增加胆汁黏度，使胆汁流动缓慢，易析出胆固醇结晶。结石胆囊黏膜中黏蛋白的表达与结石的形成密切相关［8－10］。有文献报道，约50%的结石胆囊黏膜中存在不同黏蛋白基因的表达［8］。本研究通过观察各组胆囊形态变化，发现模型组胆囊有明显的炎症、水肿，其炎症刺激了胆囊黏蛋白分泌，故胆汁中黏蛋白浓度高。另外，水肿胆囊还使胆汁排泄不畅。应用大柴胡汤治疗后，发现胆汁中黏蛋白含量、胆汁黏度明显降低，胆囊水肿减轻，改善了胆囊动力学环境。

本研究共测定了3种粘蛋白，其中MUC1、MUC2、MUC3在胆囊组织均有表达，这和陈东风等［11］的报道一致。我们发现，MUC1在结石豚鼠胆囊黏膜中存在，而且比MUC2、MUC3表达的阳性率高，提示MUC1可能是正常胆囊黏膜上皮细胞分泌的主要黏蛋白。黏蛋白与结石形成及胆囊炎症之间的关系较为复杂，推测可能系多种原因引起黏蛋白大量分泌，分子结构变化，导致或促进了胆囊结石的形成，而结石又刺激黏膜炎症的发生，腺体增生，进一步导致黏蛋白分泌改变，使结石逐渐变大，但它们之间的确切关系尚需进一步研究。

本研究发现，低剂量、中剂量、高剂量大柴胡汤和熊去氧胆酸片可明显降低豚鼠胆囊黏蛋白基因MUC3的表达(P＜0．01)，高剂量大柴胡汤和熊去氧胆酸片可明显降低豚鼠胆囊黏蛋白基因MUC1、MUC2的表达(P＜0．01)，低剂量、中剂量大柴胡汤可降低豚鼠胆囊黏蛋白基因MUC1、MUC2的表达(P＜0．05)。这可能与大柴胡汤治疗后，改善了胆囊动力学环境有关。

实验提示，大柴胡汤可使豚鼠胆汁中胆汁酸含量显著升高，使胆固醇含量显著降低;降低黏蛋白浓度，降低豚鼠胆囊黏蛋白基因表达，以小剂量为佳，中剂量次之，证明了大柴胡汤能降低豚鼠胆囊黏蛋白分泌及基因表达。本实验为临床提供了应用依据。从本次的研究可看出，运用大柴胡汤能较好溶、排胆囊胆固醇结石，其机制与调节脂质代谢，改善致石性胆汁及纠正胆囊动力学并降低胆囊粘蛋白基因表达等作用有关。

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