艾灸预处理对过度训练致心肌损伤大鼠血浆SOD/MDA、NOS和心肌COL的影响*

★ 熊英 奚人杰 孔士琛 杨晓媛 (南京中医药大学第二临床医学院 南京210023)

“治未病”是指采用一定的方法，通过增强机体的抗病与应激能力，达到防治疾病或保健的目的。艾灸是中医学“治未病”的常用手段之一，早在古代文献中就有大量艾灸防治心血管疾病的记载。在竞争日益激烈的竞技体育运动中，急性力竭运动或长期大强度运动等超负荷训练是必不可少的，但超负荷训练的运动量常导致心肌的损伤［1］。本课题组的前期实验研究已证实艾灸预处理对急性力竭运动性心肌损伤有一定的防治作用，但艾灸预处理对于长期过度训练导致的心肌损伤有无保护作用及相关机制还不清楚。

鉴于以往的研究结果，本研究在大鼠过度游泳训练模型的基础上，运用艾灸预处理进行干预，观察艾灸预处理对过度训练大鼠心肌损伤的保护作用及其对机体抗氧化能力、一氧化氮合酶的影响，为阐明艾灸预处理的心肌保护作用和机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用SPF级健康雄性SD大鼠36只，体重180～210g。大鼠常规分笼饲养，一组2笼，均以标准啮齿类动物饲料饲养，自由饮食。室温保持在20℃～22℃，相对湿度50～60%，光照时间为12h/d。大鼠参照随机数字表分为4组，包括正常对照组(C组，n=9)、一般训练组(E组，n=9)、过度训练组(OE组，n=8)和过度训练+艾灸组(OEM组，n=10)。

1.2 过度训练模型的建立［2］大鼠进行为期六周的递增负荷的过度游泳训练。先适应性喂养3d，然后适应性游泳3d。第1周进行不负重游泳30min。从第2周起每日游泳30min，负3%体重。第3周起游泳时间每日增加10min，直到60min，负4%体重。第4周每天游泳60min，负5%体重。第5周、第6周每天游泳60min，负6%体重。在整个训练期间，客观条件始终保持相同。每周训练6d，每天训练1次，水温32℃±2℃，室温保持在20℃～22℃，相对湿度50%～60%。在大鼠游泳的过程中，如发现力竭表现(鼻孔没入水面以下5～10s不能主动上浮)，便捞出水面休息5min后，继续游满规定时间。

1.3 分组 所有大鼠进入动物房后，先适应性喂养3d。E组、OE和OEM组大鼠先进行3d的适应性游泳;实验结束时，各组在同一时间麻醉取材。

C组:大鼠常规喂养，不游泳。

E组:大鼠常规喂养的同时，进行为期6周的中等强度的游泳训练，游泳时间从第1天30min逐日增加10～60min后，便不再增加，以后每日游泳训练60min(不负重)。

OE组:大鼠常规喂养的同时，进行递增负荷的过度游泳训练。

OEM组:训练方案同OE组，但每次在游泳后进行艾灸预处理，所取穴位为肾俞、后三里穴，取穴参照《实验针灸学》(李忠仁主编，中国中医药出版社，2003年出版)，使用自制麦粒灸艾炷，每次艾灸一侧的穴位，每穴5壮。

大鼠在游泳后，迅速用干毛巾擦干水分，电吹风吹干后，或放回笼中休息，或立即进行艾灸。

1.4 取材和标本制备 将大鼠用0.4%戊巴比妥钠(1mL/100g体重)腹腔注射麻醉后，呈仰卧位固定，打开腹腔，先从腹主动脉抽取4mL的血，用抗凝管装取待检测;而后打开胸腔，暴露心脏，取出心脏，一部分整心放入4%多聚甲醛中固定待测;另一部分取心室部分，用生理盐水漂洗干净，-80℃保存。

1.5 观察指标

1.5.1 心脏组织形态学观察 称取大鼠体重、心重，计算心脏重量指数。

光镜观察:取心肌组织，在4%多聚甲醛溶液中固定1周后，常规脱水、透明、浸蜡和包埋，切片后苏木素-伊红染色(HE染色)，在光学显微镜下观察心肌变化。

1.5.2 血浆生化检测 采集外周血标本并置于EDTA管抗凝，离心分离血浆，应用相关试剂盒(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)分别测定血浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的含量，操作规程严格按照说明书进行。

1.5.3 Elisa测定 采集外周血标本并置于EDTA管抗凝，离心分离血浆，应用相关测定试剂盒(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)测定内皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量。

准确称取心肌组织重量，按重量体积比加入9倍的生理盐水制成10%的组织匀浆，2 500转/分，离心10min，取上清40μL待测，按照试剂药盒及说明测定心肌胶原(COL)含量。

1.6 数据处理 实验数据采用SPSS11.5软件处理，所有数据均用平均数±标准差(¯x±s)表示，各组采用单因素方差分析(ANOVA)，多个样本均数两两比较用LSD检验，方差不齐用Dunnett’T3进行检验，以P＜0.05为显著性差异。

2 结果

2.1 心重、体重及心脏重量指数的改变 如表1所示，各组训练前的体重无显著差异。经过6周的游泳训练，各组大鼠心脏绝对重量无显著差异，但各训练组大鼠体重均显著低于C组(P＜0.01)，OE组大鼠体重显著低于E组(P＜0.05)。各训练组大鼠心脏重量指数显著增加，与C组比较有显著差异(P＜0.01)。虽然OE组和OEM组的心脏重量指数大于E组，但并无显著差异。

2.2 HE染色观察 如图1所示，C组大鼠心肌纤维排列整齐匀称，毛细血管微动静脉形态正常;E组大鼠心肌纤维排列整齐匀称，毛细血管微动静脉形态正常;而OE组大鼠心肌纤维肿胀，排列紊乱，部分断裂及局灶状坏死，小血管瘀血较严重;OEM组大鼠心肌纤维也有肿胀，排列紊乱程度比过度训练组要轻，未见断裂，瘀血不严重。

2.3 血浆SOD、MDA含量比较 见表2。与C组比较，其余三组的SOD活力值并无明显差异;但与E组比较，OE组的SOD活力值明显下降(P＜0.01);与OE组比较，OEM组的SOD活力值明显升高(P＜0.05)。

与C组比较，OE组的MDA值明显升高(P＜0.05);与E组比较，OE组和OEM组的MDA值明显升高(P＜0.01，P＜0.05);与OE组比较，OEM组的MDA值明显降低(P＜0.05)。

与C组比较，OE组的SOD/MDA值明显降低(P＜0.05);与E组比较，OE组和OEM组的SOD/MDA值明显降低(P＜0.01，P＜0.05);与OE组比较，OE组的SOD/MDA值明显升高(P＜0.05)。

2.4 血浆NO含量和iNOS、eNOS活力值比较 见表3。与C组比较，OE组的NO值明显下降(P＜0.05)。与C组和E组比较，OE组的iNOS活力值均有明显上升(P＜0.01，P＜0.05);与OE组比较，OEM组的iNOS活力值有明显下降(P＜0.05)。

表1 各组体重、心重及心脏重量指数的改变

图1 各组HE染色观察(40X)

表2 各组SOD及MDA值比较

表3 各组NO含量以及iNOS、eNOS活力值比较

表4 各组心肌COL含量的比较

与C组比较，其余三组的eNOS活力值具有显著升高(P＜0.01);与E组和OE组比较，OEM组的eNOS活力值均明显升高(P＜0.05，P＜0.05)。

2.5 心肌组织COL含量的比较 见表4。与C组比较，其余三组在心肌COL含量上具有显著升高(P＜0.05，P＜0.01);与E组比较，OE组的COL含量有明显升高(P＜0.01);与OE组比较，OEM组的COL含量有明显下降(P＜0.05)。

3 讨论

3.1 过度训练对心肌的损伤 适度的运动训练可使心脏产生良好的适应性改变，即运动心脏，表现为特有的高功能、高储备、大心脏，这是心脏生理代偿变化的结果，这些变化能增强心脏功能，提高运动能力。但过度训练可导致心肌损伤［3］。长时间大强度的运动可导致运动性疲劳和运动性心肌损伤的发生，心肌出现脂质过氧化加强、Ca2+超载等现象，由于Ca2+超载是心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的重要机制之一，其改变与运动后心肌损伤的时相性变化一致，与临床上I/R损伤的特点相似，故这种心肌损伤又称为运动性I/R损伤［1］。近年来，大量的资料也证实氧化应激与心肌纤维化的形成密切相关。氧自由基可激活基质金属蛋白酶，分解胶原蛋白，从而破坏正常的细胞外环境，导致各种生长因子的表达，引起心肌胶原重建，间质重塑，从而促进心肌纤维化。而心肌纤维化时胶原组织紧密包绕正常心肌，可以致使心肌细胞慢性缺氧，加速心肌细胞结构和功能的破坏［4］。

本研究显示，一般训练可以使心肌适应性增大，但并无胶原的增生、心肌的纤维化;机体的氧自由基代谢正常，抗氧化防御系统功能得到加强。但过度训练会导致机体的氧自由基大大增加，使机体的抗氧化防御系统功能受到影响，使心肌的结构和功能受到破坏，心脏由生理代偿逐渐转变为病理性的肥大，同时胶原增生、心肌开始出现纤维化。

3.2 艾灸预处理对过度训练所致心肌损伤的保护作用 本课题组在前期的研究中发现，艾灸对急性力竭性运动所致的心肌损伤有一定的保护作用。在本研究的结果显示，艾灸预处理对于长期过度训练所致的心肌损伤也具有一定的保护作用，心肌的充血程度和心肌纤维的断裂均有所减轻，心肌纤维化的程度也明显减轻。

3.3 艾灸预处理的心肌保护机制 NO半衰期极短(仅数秒)，不易直接测定，故常通过检测一氧化氮合成酶(NOS)来间接反映NO的代谢情况［5］。心肌组织内的NOS主要有两种亚型:eNOS和iNOS，eNOS主要存在于血管内皮细胞，由eNOS催化生成的内皮源性NO是介导内皮依赖性舒张功能的主要介质，其主要以弥散的方式进入血管平滑肌和血流，可舒张所有类型的血管，所以在组织血管的I/R中发挥着重要的作用。iNOS在受到刺激后由炎症细胞大量表达，其催化生成的NO可以与氧立即反应，生成如过氧化亚硝酸盐(ONOO-)等氧自由基，从而介导心肌的I/R损伤及内皮功能失调。

MDA是细胞膜磷脂膜受到氧化损伤时的产物，其含量升高说明体内过氧化反应比较剧烈。而SOD是体内清除超氧化物阴离子转移性的酶，自由基浓度的升高可造成SOD活性的降低［6］。

本研究表明，艾灸预处理能增强血管内皮eNOS的活力，改善血管内皮功能，体内的氧化应激反应程度也有所减轻，从而使过度训练所致的I/R损伤有所减轻。同时，艾灸预处理能一定程度抑制iNOS的活力，减少对心肌的损伤，这可能与艾灸减轻了机体的氧化应激反应，使心肌损伤减轻有关。另外，艾灸使机体SOD的活力有所提高，另一方面使机体内的SOD消耗减少，从而一定程度地纠正了机体的抗氧化防御系统功能的紊乱，心肌纤维化也有所减轻。

4 总结

一般训练能使心肌产生良好的适应性表现，心脏可生理性增大，心脏功能提高，体内的氧化防御系统功能良好。但过度训练会抑制eNOS的活力，影响内皮依赖性血管舒张功能，机体抗氧化防御系统功能紊乱，使心肌出现损伤，并有一定程度的纤维化和病理性的增大。艾灸预处理可以增强eNOS的活力，降低iNOS的活力，使血管内皮功能提高，减轻机体的氧自由基损伤，使机体的氧化防御系统功能有一定的改善，从而能一定程度地减少心肌损伤，减少心肌纤维化，对过度训练所致的心肌损伤有一定的保护作用。

［1］王莹，常芸.力竭运动后不同时相大鼠心肌核呼吸因子1的变化［J］.中国运动医学杂志，2008，27(4):458-462.

［2］李雪，袁琼嘉，熊若虹.不同负荷运动对大鼠大脑皮质超微结构的影响［J］.成都体育学院学报，2006，32(3):111-113.

［3］吴广礼，容俊芳，温进坤.近年来过度训练致脏器损伤的研究概况［J］.解放军医学杂志，2006，31(3):267-269.

［4］Sorescu D，Griendling KK.Reactive oxygen species，mitochondria，and NAD(P)H oxidases in the developmentand progression of heart failure［J］.Congest Heart Fail，2002，8(3):132.

［5］Sun HY，Xue FS，Xu YC，etal.Propofol improves cardiac functional recovery after ischemia-reperfusion by upregulating nitric oxide synthase activity in the isolated rat hearts［J］.Chin Med J(Engl)，2009，122(24):3 048-3 054.

［6］边云飞，秦卫伟，宋晓苏，等.硫化氢对氧应激所致心肌细胞损伤的影响及机制［J］.中国动脉硬化杂志2011，19(4):310-314.