基于Cx43 Ser279/282位点磷酸化介导复脉汤对缺血性心律失常的保护作用

龚一萍，沈炜毅

（浙江中医药大学，浙江杭州310053）

缝隙连接（GJ）是心肌细胞电、化学信号传递的通道，协调心肌细胞同步化收缩。缝隙连接蛋白43（Cx43）形成的连接子是其主要组成部分，其磷酸化状态程度不同，影响其自身的合成装配以及GJ的功能。Cx43的磷酸化状态受到多重激酶途径调节，发生磷酸化的位点也不尽相同，且Cx43的磷酸化位点改变与缺血性心律失常的发生密切相关。John T.Fong等［1］研究认为蛋白激酶ERK可以介导Cx43在Ser262、Ser279/282位点磷酸化，降低细胞间正常的通讯功能。本课题组前期实验发现复脉汤能抑制EKR的表达量，逆转EKR介导Cx43 Ser262位点的磷酸化通道，维持缝隙连接蛋白结构，维系缝隙通讯功能，降低缺血性心律失常的发生率。本实验欲以Cx43 Ser279/282磷酸化水平为靶点，探讨复脉汤对缺血性心律失常保护作用的内在机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD雄性大鼠58只，动物许可证号：2008001638685，体重 200～300 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。饲养条件：饲养于浙江中医药大学实验动物中心，清洁饲养室保持恒温（20℃），相对湿度40%～60%。

1.1.2 药物与试剂 复脉汤（由炙黄芪20 g，生晒参10 g，丹参 15 g，川芎 10 g，红花 10 g，红景天 10 g，延胡索10 g，酸枣仁15 g，制远志10 g等组成，单味中药均由浙江中医药大学中医门诊部提供）；炙甘草汤（炙甘草 12 g，生姜 9 g，桂枝 9 g，党参 6 g，生地黄 25 g，阿胶 6 g，麦冬 10 g，麻子仁 10 g，大枣 10枚。单味中药由浙江中医药大学中医门诊部提供）；酒石酸美托洛尔（50 mg/片，批号：H32025390）由阿斯利康制药有限公司提供。主要试剂：3%戊巴比妥钠（美国 Sigma，Sigma-P3761），兔抗 Cx43 Ser279/282 多克隆抗体（SANTA CRUZ公司自制），内参GAPDH抗体（up-date公司），ECL增强型化学发光显色试剂盒（Ther-mo公司），PVDF膜（Life Science公司），辣根碱过氧化物酶标记的山羊二抗（Novogene公司）。

1.1.3 实验仪器 ALc-V9小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司），小动物多道生理记录仪（法国ekma），高速组织匀浆器（美国Pro公司），化学发光、荧光和可见光凝胶成像系统（美国OmegaLum G公司），可调微量加样器（德国Eppendorf公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 将58只SD大鼠按随机数字表法分为7组，假手术组、美托洛尔组、炙甘草汤组，复脉汤高、中、低剂量组，每组8只，模型组10只。美托洛尔组给药浓度10 mg/mL，炙甘草汤组0.940 mg/mL，复脉汤高剂量组3.750 g/mL，复脉汤中剂量组1.875 g/mL，复脉汤低剂量组0.9375 g/mL，每只按照10 mL/kg灌胃给药，1次/d，假手术组及模型组给予等体积生理盐水，连续灌胃2 w。

1.2.2 模型制备 大鼠急性心肌缺血模型制作参考文献［2］的方法，通过左冠状动脉前降支结扎略作改进。连续灌胃2 w后，将手术大鼠分笼饲养，禁食12 h，自由饮水。次日各组大鼠术前1 h给药并称重后，以3%戊巴比妥钠以1.5 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉满意后仰卧固定于鼠台上，颈部与胸部皮肤去毛，常规消毒。逐层分离颈部皮肤、肌肉，暴露气管，开胸前气管插管，连接动物呼吸机行人工呼吸（频率为 60 次/min，潮气量 2.5 mL/100 g，呼吸比为 2∶1）。四肢皮下连接心电图电极，记录Ⅱ导联心电图。在胸骨左侧第3、4肋骨处切开皮肤，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，用开睑器撑开胸腔，剥开心包膜，用镊子轻轻掀开左心耳，以左心耳与肺动脉圆锥间的左冠状静脉主干为标志，结扎的位置定在左心耳下缘1～2 mm，用6-0号无创带针缝合线穿过左冠状动脉前降支，进针深度控制在1～2 mm，宽约2 mm，结扎冠状动脉左前降支，造成急性心肌缺血动物模型。结扎即刻左室前壁及心尖部心肌颜色苍白，结扎成功的标志为心电图II导联R波振幅明显抬高，ST段抬高大于0.15 mV。假手术组只穿线不结扎，其余步骤相同。术后暖光灯调节大鼠体温在37℃左右，及时清除大鼠气管分泌物，出现室颤用棉签轻轻按压心脏除颤。

1.2.3 观察指标 记录各实验组每只大鼠缺血后心律失常出现时间以及缺血期间心律失常的发生次数。检测各实验组心肌细胞Cx43 ser279/282磷酸化水平。

取缺血心肌组织100 mg，研磨至粉末，加入1000μL裂解液匀浆，在4℃下以12000 rpm离心20 min，取上清液，采用紫外分光光度计测定蛋白浓度。根据浓度，制备50 μg上样蛋白。

配制10%分离胶10 mL，灌胶至玻璃板2/3处，再将5%浓缩胶注入，直至离玻璃顶部1 cm处，将梳子插入浓缩胶液体中，室温聚合30 min。拔出梳子，以电泳缓冲溶液冲洗点样孔。用电泳缓冲溶液充满电泳槽的上下槽，用微量注射器将50 μg制备好的蛋白样品加入到加样孔中，空置加样孔用等体积的加样缓冲液填充。浓缩胶加电压8 V/cm，进入分离胶后改电压为15 V/cm，进行电泳，至溴酚蓝到达分离胶的底部后电泳结束。

转膜前准备适当大小的PVDF膜和滤纸。PVDF膜在甲醇浸泡1～2 min活化，然后与预冷在转膜缓冲液的滤纸、海绵，依次配成海绵垫→3层滤纸→凝胶→PVDF膜→3层滤纸→海绵垫，将滤纸、胶、PVDF膜对齐，将每层间的气泡排空，加入电转缓冲液，连接电源，80 V冰浴中转印2 h。

封闭：将转膜放入以TBST溶解的5%BSA液中封闭2 h。

一抗孵育：将PVDF膜放入TBST稀释的兔抗Cx43 ser279/282磷酸化多克隆抗体和内参（GAPDH）多克隆抗体（1∶200），4 ℃过夜。

二抗孵育：加入辣根碱过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h。

显色：取出膜，在滤纸上沥干液体，将膜浸入ECL发光液（A 液∶B 液=1∶1），反应 2～3 min；将 PVDF 膜置于塑料薄膜上，在化学发光凝胶成像系统下曝光显影，图片经Image Pro-Plus软件处理图像中蛋白条带，分析各组Cx43和GAPDH蛋白灰度值。

1.3 统计学方法

2 结 果

冠状动脉左前降支结扎成功率100%，模型组因结扎过深，出现恶性心律失常导致死亡2只，余均存活至实验结束。

2.1 对缺血性心律失常的影响

各组心律失常出现时间及发生次数比较，结果见表1。

表1 各组心律失常出现时间以及发生次数的比较（±s）

表1 各组心律失常出现时间以及发生次数的比较（±s）

注：与模型组比较，1）P<0.01；与炙甘草汤组比较，2）P<0.01，3）P<0.05

组别 n 心律失常出现时间（s） 心律失常（次）假手术组 8 - -模型组 8 134.88±22.21 849±136美托洛尔组 8 189.00±18.421）2） 338±1821）2）炙甘草汤组 8 149.63±32.01 674±89复脉汤高剂量组 8 193.63±28.341）2） 329±1931）2）复脉汤中剂量组 8 182.75±26.441）3） 440±2111）3）复脉汤低剂量组 8 174.50±23.121） 493±2071）3）

由表1可见，与模型组比较，复脉汤高、中、低剂量组及美托洛尔组心律失常出现时间显著延迟，缺血性心律失常发生次数显著减少（P<0.01）；与炙甘草汤组比较，复脉汤中、高剂量组及美托洛尔组心律失常出现时间明显延迟，复脉汤各剂量组及美托洛尔组缺血性心律失常发生次数显著减少（P<0.05，P<0.01）。

2.2 各组心肌组织Cx43 ser279/282磷酸化水平比较

结果见图1、图2。

图1 各组心肌组织Cx43 ser279/282磷酸化相对表达量

图2 复脉汤对心肌组织Cx43 pser279/282的影响

假手术组Cx43 ser279/282磷酸化相对表达量（Cx43 pser279/282/GAPDH）为（1.0763±0.0895），模型组为（1.6399±0.0942）；复脉汤高、中、低剂量组，美托洛尔组Cx43 pser279/282/GAPDH分别为（1.3353±0.0924）、（1.3850±0.0551）、（1.4351±0.0858）、（1.3481±0.0386）。与模型组比较，假手术组、复脉汤各剂量组及美托洛尔组均显著降低（P<0.01）；炙甘草汤组Cx43 ser279/282/GAPDH 为（1.5383±0.0636），与炙甘草汤组比较，复脉汤高、中剂量组及美托洛尔组显著降低（P<0.05，P<0.01）；复脉汤各剂量组与美托洛尔组比较差异无统计学意义（P>0.05），复脉汤各剂量组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨 论

最新研究发现，心肌缺血时细胞内的氧自由基增加、钙超载、酸中毒等可导致缝隙连接的结构和功能发生改变，引起电脱耦联诱发缺血性心律失常［3］。研究发现，PKC、PKA、ERK、CK1等蛋白激酶可以使Cx43蛋白羧基末端丝氨酸（serine ser）残基的多个位点发生磷酸化。有研究发现蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通过磷酸化Cx43丝氨酸残基368位点而实现降低Cx43通道通透性和调节缝隙连接通讯的作用［4］。酪蛋白激酶 1（casein kinase 1，CK1）可直接磷酸化Cx43的325、328或330位点的丝氨酸，调节细胞膜上的Cx43装配形成GJ通道，使GJ传导性增加［5］。胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）是通过磷酸化Cx43 ser262或ser279/282位点，使缝隙连接从细胞与细胞间内吞到细胞内，使细胞间的通讯功能降低。

前期实验研究发现，复脉汤通过抑制EKR的表达量，逆转EKR介导Cx43 Ser262位点的磷酸化，维持缝隙连接蛋白结构，维系缝隙通讯功能，对缺血性心律失常起到保护作用［6］。本实验数据显示，复脉汤各剂量组与模型组比较Cx43 ser279/282磷酸化水平显著降低（P<0.01），提示复脉汤对缺血性心律失常的保护作用可能与降低Cx43 Ser279/282磷酸化水平有关。复脉汤高、中剂量组Cx43 Ser279/282磷酸化水平明显低于炙甘草汤组（P<0.01），说明复脉汤抑制Cx43 Ser279/282磷酸化水平呈剂量依赖性。复脉汤与美托洛尔对抑制Cx43 Ser279/282磷酸化水平作用效果相当。

越来越多的证据表明，非抗心律失常的药物能够减少患者死于心律失常的风险时，β受体阻滞剂、他汀类药物、ACEI和ARB类等药物，能改善心肌缺血缺氧、酸中毒的微环境以及修复缺血引起心律失常病理结构。复脉汤治疗气虚血瘀型心律失常临床疗效显著。益气活血的中药可以修复心肌缺血产生心律失常病理组织结构，从本治疗心律失常［7］。炙甘草汤以益气养阴为法则治疗心律失常，缺少活血化瘀药，对心肌缺血保护作用不明显，故效果不及复脉汤。复脉汤中丹参、红花、川芎等活血化瘀中药可改善缺血区的血液微循环，保证心肌细胞正常功能，保障心肌细胞及细胞间结构的完整性，抑制心律失常的发作。又经药理研究证实，复脉汤中黄芪、生晒参、丹参、甘松等中药的有效成分对心律失常发生有直接对抗作用。陆文娟等［8］研究发现黄芪甲苷、人参总皂苷对蟾酥致小鼠心律失常有一定的保护作用。杨萍等［9］研究认为丹参酮IIA对缺血再灌注损伤大鼠心肌组织和心律失常具有良好的保护作用。路永平等［10］研究发现甘松具有抗心肌缺血，提高心肌耐缺氧能力及抗心律失常作用，对氯化钠、氯仿-肾上腺素引起的心律失常有对抗作用，其提取物缬草酮对异位性室性节律有较强的抑制作用。

综上所述，复脉汤对缺血性心律失常的保护作用与抑制Cx43 Ser279/282磷酸化信号通道，维持细胞间通讯功能有关。效果优于炙甘草汤，与美托洛尔作用相当，其机制可能与改善心肌缺血，保证心肌细胞完整性，维持心肌细胞间正常结构有关。

［1］John T.Fong，Wutigri Nimlamool，Matthias M.Falk.EGF induces efficient Cx43 gap junction endocytosis in mouse embryonic stem cell colonies via phosphorylation of Ser262，Ser279/282，and Ser368［J］.FEBS，2014，588（5）：836-844.

［2］周文武，刘玲，陈军，等.冠状结扎法制做大鼠心肌缺血模型［J］.中国实验动物学，2004，12（4）：226-230.

［3］王广强.步长稳心颗粒通过调节Cx43稳定性抗缺血性心律失常作用研究［D］.长春：吉林大学，2013.

［4］EK-Vitorin J F，King T J，Heyman N S，et al.Selectivity of connexin 43 channels is regulated through protein kinase C-dependent phosphorlation［J］.Circ Res，2006，98（12）：1498-1505.

［5］Cooper C D，Lampe P D.Casein kinase 1 regulates connexin-43 gap junction assembly［J］.J Biol Chem，2002，277（47）：44962-44968.

［6］龚一萍，沈炜毅.基于Cx43磷酸化信号通路介导复脉汤对缺血性心律失常的保护作用［J］.辽宁中医药大学学报，2015，17（8）：5-7.

［7］李惠霞，王淑丽.益气活血汤治疗缺血性心律失常 72例［J］.实用中医内科杂志，2008，22（5）：16.

［8］陆文娟，周婧，马宏跃，等.黄芪甲苷、人参总皂苷和西洋参总皂苷对蟾酥致小鼠心律失常的影响［J］.南京中医药大学学报，2012，28（1）：61-64.

［9］杨萍，贾钰华，李杰，等.丹参酮IIA对缺血再灌注损伤大鼠心律失常及IMA、H-FABP水平的影响［J］.中药新药与临床药理，2009，20（6）：517-520.

［10］路永平，王丽.从细胞电生理角度阐述甘松抗心律失常机理［J］.浙江中医杂志，2009，44（9）：678-679.