JNK与Smad信号通路在小鼠肺纤维化中相互作用的研究及对Ⅰ型胶原表达的影响

秦世鹏第

[摘要] 目的 探讨JNK与Smad途径介导小鼠肺纤维化中Ⅰ型胶原的表达及二者相互作用的研究。 方法 选择雄性野生健康C57BL/6小鼠96只，随机分为正常组（N组）、模型组（M组）、p-Smad3阻断组（SB组）、JNK阻断组（SP组），每组24只。M组、SB组及SP组气管内滴注博莱霉素3.5 mg/kg诱导肺纤维化模型，于造模后给予相应药物，N组给予等剂量生理盐水。每组分别于造模后第7、14、28天随机处死8只小鼠，取肺组织病理切片行HE染色和Masson染色，观察肺泡炎和纤维化程度；碱水解法检测肺组织羟脯氨酸（Hyp）含量；免疫组化法测定肺组织Ι型胶原、p-JNK及p-Smad蛋白含量，各组进行对比。 结果 M组第7天肺泡炎症明显，第28天纤维化改变显著；随着时间推移，羟脯氨酸含量呈逐渐上升趋势，第28天含量最高。SB组、SP组与M组比较，肺泡炎症及纤维化程度均有所减轻；第14、28天Hyp含量稍降低，Ⅰ型胶原、p-JNK及p-Smad蛋白的表达有所减少（P<0.05）。结论 肺纤维化与JNK及Smad通路关系密切，JNK与Smad信号通路在TGF-β1诱导的ECM过度聚集发挥重要作用；JNK的活化会增加Smad3蛋白的磷酸化，而Smad途径的激活也会加强JNK的活化，两条通路的相互关联将为进一步治疗肺纤维化提供新思路。

[关键词] 肺纤维化；转化生长因子β1；JNK信号通路；Smad信号通路；Ⅰ型胶原

[中图分类号] R563.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）09-0001-05

Study of JNK and Smad signal pathways interaction in pulmonary fibrosis in mice and the influence on the expression of type I collagen

QIN Shipeng1 LIU Xuejun2 WANG Xiaohui2 ZHONG Jianke2 DU Yufeng2

1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.Department of Geriatrics，the First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of type Ι collagen in JNK and Smad mediated pulmonary fibrosis of mice and study the interactions between the two mediation. Methods Ninety-six healthy wild male C57BL/6 mice were randomLy divided into four groups，the normal group（N group，n=24），the model group（M group，n=24），the p-Smad3 blocking group（SB group， n=24） and the JNK blocker group（SP group，n=24）. M group，SB group and SP group were endo-tracheal driped by bleomycin（3.5 mg/kg） to estabish pulmonary fibrosis model and then given corres-ponding drugs， while the N group was given isodose physiological saline. Eight mice in each group were randomly killed on the 7th，14th，28th. The degree of alveolitis and pulmonary fibrosis by the mice lung tissue pathological in HE staining and Masson staining were observed，lung tissue hydroxyproline（Hyp） content by alkaline hydrolysis method were and dected each groups lung tissue of type I collagen，p-JNK and p-Smad protein content by immunohistochemical determination were compared. Results The degree of pulmonary alveolitis of M group was obvious on the 7th day after modeling and the fibrosis was reduced significantly on the 28th day. The Hyp increased gradually and reached the maximum level on the 28th day. The pulmonary alveolitis and fibrosis of lung tissue in SB，SP and N group were in a relatively low degree，compared with M group. The Hyp ration of these groups were on a slightly lower level；the expression of type I collage，p-JNK and p-Smad protein were reduced（P<0.05）. Conclusion Pulmonary fibrosis are closely associated with JNK and Smad pathway，JNK and Smad signaling pathway play an important role in TGF-β1 induced excessive accumulation of ECM.The activation of JNK may increase the phosphorylation of Smad3 protein， and the activation of Smad pathway can also be activated to strengthen JNK.This two interrelated pathways will provide new ideas for the step in the treatment of pulmonary fibrosis.

[Key words] Pulmonary fibrosis；Transforming growth factor β1；JNK signaling pathway；Smad signaling pathway；Type Ι collagen

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是一种早期以肺泡炎症，后期以大量成纤维细胞（fibroblast，FB）异常增殖和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）大量沉积为主要表现特点的肺间质疾病[1]。转化生长因子β1（TGF-β1）是重要的致纤维化因子，通过多个信号通路发挥作用，JNK及Smad信号通路是其下游的重要信号通路，p-Smad3高表达与炎症纤维化的发展密切相关[2]。Ⅰ型胶原是ECM中反映肺纤维化程度的主要指标，本研究主要使用特异性阻滞剂阻断Smad及JNK信号通路后，观察Ⅰ型胶原的变化程度以及两条通路的相互关联。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取18～20 g雄性野生C57BL/6小鼠96只，2014年1月购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，于山西医科大学动物实验中心饲养，SPF级。博莱霉素（日本化药株式会社），SP600125、SB431542及二甲基亚砜（DMSO）溶液（美国sigma公司）；Masson染液试剂盒、羟脯氨酸试剂盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗鼠p-JNK、p-Smad3及Ⅰ型胶原多克隆抗体（美国Bioworld公司）；SABC试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色剂（武汉博士德公司）。

1.2 模型分组及处理

选择雄性野生健康C57BL/6小鼠96只，随机分为正常组（N组）、模型组（M组）、p-Smad3阻断组（SB组）和JNK阻断组（SP组），每组24只。N组给予气管内滴注0.9%氯化钠注射液0.04 mL，其余三组气管内滴注博来霉素0.04 mL（3.5 mg/kg）建立肺纤维化模型。SP组采用SP600125溶于二甲基亚砜（DMSO）溶液，腹腔注射0.03 mL（15 mg/kg），于造模当日注射；其余各组腹腔注射相同剂量的二甲基亚砜（DMSO）溶液；SB组于造模后第3、4、5天腹腔内注射SB431542（按4.2 mg/kg，0.5 mL/只，溶于10%乙醇），其余三组给予等体积10%乙醇。

1.3 组织指标测定

每组分别于造模后第7、14、28天随机处死8只小鼠，取肺组织病理切片行HE染色和Masson染色，观察肺泡炎和纤维化程度；碱水解法检测肺组织羟脯氨酸（HYP）含量；免疫组化法测定肺组织Ι型胶原、p-Smad3及p-JNK蛋白含量，各组进行对比。

1.4统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学改变

N组各时间点肺泡壁完整，肺泡腔大小均匀且无明显渗出，偶可见少量炎细胞或成纤维细胞，支气管壁完整（图1）；M组小鼠第7天出现明显的肺泡炎，肺泡间隔增宽，肺泡间隔及肺泡腔内单核巨噬细胞增生，可见少量成纤维细胞增生，病灶内见肺泡萎缩，Masson染色蓝染的胶原纤维表达量少（图2）；第14天炎症稍减轻，仍见少量炎症细胞的浸润，包括少量中性粒细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞，可见成纤维细胞增多，肺泡间隔显著增厚、增宽，肺泡壁、支气管壁增厚，部分肺泡萎缩、闭合，Masson染色见蓝染的胶原纤维表达量增多（图3）；第28天肺泡炎症程度明显减轻，肺泡结构破坏严重，肺间质内见成纤维细胞大量增生，纤维化程度加重，Masson染色见蓝染的胶原纤维表达增多（图4）。SB组、SP组镜下观察，各时间点炎症反应及纤维化程度均较M组减轻（图5～19）。

2.2肺组织羟脯氨酸含量的测定

N组羟脯氨酸有少量表达，其他各组羟脯氨酸的表达均随时间延长而增加，第28天达高峰。第7天各组Hyp含量比较，差异有统计学意义，第14、28天M组、SB组、SP组较N组表达明显增多，SB组、SP组较M组表达明显减少，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 肺组织羟脯氨酸含量（x±s，μg/mg，n=8）

注：与N组比较，aP<0.05；与M组比较，bP<0.05

2.3 肺组织p-JNK蛋白免疫组织化学结果

N组偶有少量阳性表达，主要见于肺泡上皮细胞及小气道上皮细胞；M组主要见于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、小气道上皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞及浸润炎症细胞的胞浆、胞核，各时间点灰度值均较N组显著降低，即p-JNK蛋白表达均较N组显著增多，差异有统计学意义（P<0.05）；M组表达从第7天开始升高、第14天达高峰、第28天开始下降；SB组、SP组与M组变化趋势基本相同，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 肺组织p-JNK蛋白灰度值（x±s）

注：与N组比较，aP<0.05；与M组比较，bP<0.05

2.4肺组织p-Smad蛋白免疫组织化学结果

N组偶有少量阳性表达，多见于肺泡上皮细胞及小气道上皮细胞；M组多见于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、小气道上皮细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞，巨噬细胞及浸润炎症细胞的胞质、胞核阳性表达增多；各时间点p-Smad蛋白灰度值均较N组显著降低，即p-Smad蛋白表达均较N组显著增多，差异有统计学意义（P<0.05）；M组表达从第7天开始升高、第28天达高峰；SB组、SP组与M组变化趋势基本相同，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 肺组织p-Smad蛋白灰度值（x±s）

注：与N组比较，aP<0.05；与M组比较，bP<0.05

2.5 肺组织Ⅰ型胶原免疫组织化学结果

N组各时间点呈弱阳性反应，主要分布于支气管周围、血管周围及肺泡间隔处，灰度值最大（注：灰度值越大说明蛋白表达越少），即N组有少量I型胶原蛋白表达；其他三组第7天表达较N组分布明显增加，但差异无统计学意义。第14、28天时在M组肺内分布迅速增加，呈条索状、斑片状分布，于肺泡间隔处增加最显著，各时间点灰度值均较N组显著降低，即M组各时间点I型胶原含量较N组显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）；M组表达从第7天开始升高、第28天达高峰；SB组、SP组与M组变化趋势基本相同，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3 讨论

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是一种原因不明的慢性间质性肺疾病，以成纤维细胞增生和ECM过度分泌为主要病理特征，ECM分泌大量胶原以进行性积聚的方式逐渐破坏正常肺组织结构，最终形成肺纤维化[3]，其中FB转化为肌成纤维细胞是这个过程中的关键，此后肌成纤维细胞能合成大量ECM，其主要成分为Ⅰ、Ⅲ型胶原，同时又能减少ECM的降解，使其发生过度沉积，导致肺纤维化的发生[4]。马跃文[5]及Brown[6]等认为在纤维化的过程中，细胞外基质的主要成份Ⅳ、Ⅵ胶原等逐渐被Ⅰ、Ⅲ胶原和细胞纤连蛋白等取代，Ⅰ、Ⅲ胶原构成ECM的主要成份。在试验中也发现，博莱霉素可诱导小鼠肺组织成纤维细胞增生，以Ⅰ型胶原增生为主，呈现时间递增关系，第28天时达高峰，因此Ⅰ型胶原作为肺组织细胞中的主要胶原成分，成为评价博莱霉素肺纤维化模型的特异指标[7]。本实验证明SB组、SP组ECM的I型胶原含量各时间点灰度值均较M组显著减少；SB组I型胶原灰度值均较SP组显著升高，Ⅰ型胶原蛋白分泌明显减少，提示抑制这两条通路均具有改善肺纤维化的作用。

转化生长因子β1（transforming growth factor beta l，TGF-β1）目前被大多数学者认为是肺纤维化形成和发展的关键细胞因子[8，9]，对ECM的生成和沉积起调节作用，还可促进成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞是纤维化的主要成份，不仅增强胶原合成，且具有收缩性，使肺组织结构破坏[10-12]。TGF-β1通过多个信号通路发挥作用，Smad3是其下游的重要信号分子之一，p-Smad3高表达与炎症纤维化的发展密切相关。TGF-β1表达上调，促进Smad3高表达，进而促进各种促炎因子分泌，加速炎症纤维化病变进程。本研究中M组Ⅰ胶原表达水平增高，胶原沉积明显，与其相应的TGF-β1及其下游的Smad3 mRNA表达水平增高；在特异性拮抗剂SB431542干扰后，肺组织Smad3表达水平降低，Ⅰ胶原表达水平降低，胶原沉积减少，肺纤维化程度明显降低。

JNK信号通路为TGF-β1下游的另一重要信号转导通路，TGF-β1诱导纤维母细胞增殖，转化为肌成纤维细胞及ECM，如Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）过度聚集的过程中起重要作用[13，14]。JNK的异常表达可影响TGF-β1的活性，进而改变纤维化的进程。本课题组前期研究曾提出，通过阻断TGF-β介导的JNK信号转导通路可以有效减轻肺纤维化的程度，本实验也证明在JNK特异性拮抗剂SB600125干扰后，小鼠肺组织p-JNK蛋白表达水平降低，Ⅰ型胶原表达水平降低，胶原沉积较M组减少，肺纤维化程度明显降低。

JNK信号通路是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的重要一员，其作为TGF-β1下游的重要信号通路，参与调控许多细胞增殖、分化与凋亡。在体外TGF-β介导的细胞转录过程，JNK与Smad信号传导通路相互依赖[15]，JNK可以通过磷酸化Smad3来增强Smad信号通路，同时，Smad通路通过增加JNK诱导的转录因子AP-1即c-jun的活性来增强JNK信号通路[16]。通过体外实验研究表明：JNK信号通路在TGF-β诱导的鼠腹膜间皮细胞的上皮-间质转化中发挥重要作用，可能是通过磷酸化Smad3实现的[17]。Velden JL研究表明[18]，在体外实验，JNK通过磷酸化Smad3和增强其转录活性来促进TGF-β诱导的EMT，同时，JNK1能调节Smad3/4复合物的核转运并增强Smad3与Smad4之间的交互作用。本实验表明，在小鼠肺纤维化过程中，阻断JNK及Smad信号通路，对改善肺纤维化均有一定程度的作用，其中Ⅰ型胶原作为反映肺纤维化程度的主要指标，JNK较Smad信号通路灰度值稍高，表明Smad致纤维化程度较JNK通路明显。

总结，本实验证明在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中，JNK和Smad信号通路通过增加肌成纤维细胞的形成及Ⅰ型胶原的表达致纤维化，阻断其中任何一条信号通路，也会对另一条信号通路产生影响，抑制肺纤维化的进展。JNK及Smad途径可以相互作用，但抑制以上途径尚不能完全阻止肺纤维化的发展，因此肺纤维化的发病机制仍需进一步深入研究，从而为临床肺纤维化的治疗提供新思路。

[参考文献]

[1] Geiser T. Idiopathic pulmonary fibrosis-a disorder of alveolar wound repair[J]. Swiss Med Wkly，2003，133（29-30）：405-411.

[2] 周春光，黄越龙，张谊，等. 大鼠肝纤维化过程中肝脏组织转化生长因子β1、Smad3蛋白和胶原纤维的动态变化[J]. 中华实验外科杂志，2012，29（3）：556.

[3] Katzenstein AL，Myers JL. Idiopathic Pulmonary Fibrosis.Clinical relevance of pathologic classification[J]. Am J Respir Crit Care Med，1998，157（4 Pt 1）：1301-1315.

[4] Chung MP，Monick MM，Hamzeh NY，et al. Role of repeated lung injury and genetic background inbleomycin-induced fibrosis[J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2003，29（3 pt l）：375-380.

[5] 马跃文，佟振月，侯显明. 肺纤维化过程中不同种类胶原异常沉积及分布规律的实验研究[J]. 中国医科大学学报，2009，38（6）：407-409.

[6] Brown B，Lindberg K，Reing J，et al. The basement membrane component of biologic scaffolds derived from extracellular matrix[J]. Tissue Eng，2006，12（3）：519-526.

[7] 郝小惠，张丽，王献华. 胶原与肺间质纤维化的研究进展[J]. 华北煤炭医学院学报，2005，7（1）：43-45.

[8] Cutroneo KR，White SL，Phan SH，et al. Therapies for bleomycin induced lung fibrosis through regulation of TGF-betal induced collagen gene expression[J]. J Cell Physiol，2007，211（3）：585-589.

[9] McMillan SJ，Xanthou G，Lloyd CM. Manipulation of allergen-induced airway remodeling by treatment with anti-TGF-beta antibody：Effect on the Smad signaling pathway[J].J Immunol，2005，174（9）：5774-5780.

[10] Phan SH. Biology of fibroblasts and myofibroblasts[J]. Proc Am Thoraec Soc，2008，5（3）：334-337.

[11] Phan SH. The myofibroblast in pulmonary fibrosis[J]. Chest，2002，122（6 Suppl）：286S-289S.

[12] Fattman CL. Apoptosis in pulmonary fibrosis：Too much or not enough？[J]. Antioxid Redox Signal，2008，10（2）：379-385.

[13] Santibafiez JF. JNK mediates TGF-betal-induced epithdial mesenchymal transdiff-crentiation of mouse transformed keratinocytes[J]. FEBS Lett，2006，580（22）：5385-5391.

[14] Alcom Van der Velden J，Brown AL，et al. c-Jun N-terminal kinase 1 is required for the development of pulmonary fibrosis[J]. Am J Respir Cell M01 Biol，2009，40（4）：422-432.

[15] Mori S，Matsuzaki K，Yoshida K，et al. TGF-beta and HGF transmit the signals through JNK-dependent Smad2/3 phosphorylation at the linker regions[J]. Oncogene，2004， （23）：7416-7429.

[16] Michael E. Engel，Maureen A. McDonnell，Brian K. Law，and Harold L.Moses. Interdep-endent SMAD and JNK Signaling in Transforming Growth Factor-β mediated Transcri-ption[J]. The Journal of Biological Chemistry，1999，274（52）：37413-37420.

[17] Liu Q，Mao H，Nie J，et al. Transforming growth factor {beta}1 induces epithelial-mesenchymal transition by activating the JNK-Smad3 pathway in rat peritoneal mesothelial cells[J]. Peritoneal Dialysis International，2008，28（Suppl 3）：S88-95.

[18] Velden JL，Alcorn JF，Guala AS，et al. C-Jun N-terminal kinase 1 promotes transforming growth factor-β1 induced epithelial-to-mesenchymal transition via control of linker phosphorylation and transcriptional activity of Smad3[J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2011，44（4）：571-581.

（收稿日期：2014-12-15）