鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定

吴翠兰 （广东省深圳市龙岗街道动物防疫监督所 广东深圳 518001）

鸡白痢沙门氏菌病（简称鸡白痢）是危害雏鸡和成年鸡的一种典型垂直传播性疾病。该病呈急性或慢性败血症过程。在雏鸡和成年鸡中所表现的症状和病程有所不同。雏鸡主要表现为肠炎，呼吸困难和灰白下痢。成年鸡感染后呈纤维素性腹膜炎，肝肿大，肠道肿胀出血等特征[1-3]，死亡率较高。其传播途径有多种，最常见的是通过带菌卵而传播。多种禽类（如鸡、火鸡、鸭、雏鹅、珠鸡、野鸡、麻雀和鸽等）都有自然感染的报导。但流行主要限于鸡和火鸡，尤其鸡对本病较敏感。在哺乳动物中，兔特别是乳兔有较高的易感性。豚鼠、小白鼠和猫也能被感染，大鼠则有很强的抵抗力。有人曾在猪体内分离到该菌，儿童亦偶有感染本病的报导。

鸡白痢沙门氏菌对鸡品种间易感性也有差异。一般而言，褐羽产褐壳蛋鸡敏感，轻型鸡较其他品种的鸡敏感，地面平养的鸡群发生此病较网上和笼养的鸡要多。母鸡的阳性率高于公鸡，在雏鸡常表现为急性全身性感染。在种鸡群中，其不仅影响成年鸡的生产性能，而且可经垂直传播和水平传播导致胚胎死亡率增高，但以2～3周龄以内的雏鸡的发病率与死亡率最高，常呈流行性暴发。新发病的雏鸡死亡率可高达100%，老疫区一般为20%～40%。严重影响雏鸡成活率。随着日龄的增加，鸡对本病的抵抗力增强，如4周龄后的鸡发病率和死亡率显著下降。成年禽感染后常呈局限性、慢性感染或隐性感染。1899年首次报导了此病的病原，1929年正式命名为“鸡白痢”[4]，并一直沿用至今。在检测上，其易与大肠杆菌、禽伤寒沙门氏菌相混淆，这便又给诊断该病带来一定的困难，给养鸡业带来一定的损失。农业部将该病列为14种重点监测的动物疫病之一[5]。目前国内尚未报导有在鸡群使用疫苗预防鸡白痢，因此通过提高分离检测水平，对鸡场特别是种鸡场净化鸡白痢有着现实的意义。

对于本病，其预防措施主要有定期检疫，净化种鸡群。及时剔除阳性鸡及可疑鸡。对已感染的鸡群应每隔2～4周检疫1次，直至把带菌鸡全部检出淘汰。同时还要采用全进全出和自繁自养的管理措施及生产模式。加强饲养管理，每次入鸡前都要对鸡舍、设备、用具及周围环境进行彻底消毒并至少空置1周。种蛋入孵前要做好孵房、孵化机用所有用具的清扫、冲洗和消毒工作。用药方面也要合理，防止出现耐药菌株。

本试验是通过传统方法如细菌的显微镜检，几种培养基下的生长情况观察、运动性观察和生化试验进行检测判定，再进行药敏试验来检测其耐药性，从而指导生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

病料来源为某场的一个送检鸡只。临床观察病鸡形态，尾部毛染有白色粪便，精神沉郁，站立不稳。剖检可见心、肝和肺都有灰白色结节，肝脏有点状白色坏死。

1.1.2 培养基

麦康凯琼脂培养基：广东环凯微生物科技有限公司。按麦康凯培养基使用说明书配制好，放入高压蒸汽灭菌器进行灭菌。待温度降到50℃左右时，无菌分装至高压灭菌处理的平皿中，冷却至室温，4℃保存备用。

SS培养基：北京市陆桥技术有限责任公司。按照SS培养基的使用说明进行配制，待温度降到50℃左右时，无菌分装至高压灭菌处理的平皿中，冷却至室温，4℃保存备用。

XLD培养基：广东环凯微生物科技有限公司。按照XLD培养基的使用说明进行配制，待温度降到50℃左右时，无菌操作分装至高压灭菌处理的平皿中，冷却至室温，4℃保存备用。

科玛嘉培养基：郑州博赛生物技术股份有限公司。按照科玛嘉培养基的使用说明进行配制，待温度降到50℃左右时，无菌分装至高压灭菌处理的平皿中，冷却至室温，4℃保存备用。

DHL培养基：杭州天和微生物试剂有限公司。按照DHL培养基的使用说明进行配制，待温度降到50℃左右时，无菌分装至高压灭菌处理的平皿中，冷却至室温，4℃保存备用。

1.1.3 生化反应管

分别有葡萄糖生化反应管、乳糖生化反应管、蔗糖生化反应管、甘露醇生化反应管、麦芽糖生化反应管、卫矛醇生化反应管、鸟氨酸生化反应管、吲哚生化反应管、尿素生化反应管和半固体生化反应管10种，均为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.1.4 仪器与设备

洁净工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂，型号04012。光学显微镜：Nikon YS100。革兰氏染液；Kovacs试剂等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离及纯化

用无菌操作方法，对病（死）鸡的心、肝和脾进行细菌分离。分别接种于麦康凯培养基、SS培养基、科玛嘉培养基、DHL培养基和XLD培养基中，37℃培养24h，观察各平板上生长情况并进行纯化。

1.2.2 革兰氏染色显微镜检

在洁净工作台上，取一块洁净的玻璃片，在玻璃片中间加1滴灭菌的双蒸水，用灭菌后的接种环取1个菌落在玻璃片上均匀涂布，将菌落分散为单个细菌，按照革兰氏染色程序染色。油镜下观察细菌的形态。

1.2.3 运动性检查

将“1.2.1”.获得的待检纯化菌落用灭菌接种棒垂直中心穿刺接种于半固体动力培养基中，于37℃培养24h，观察结果。

1.2.4 氧化酶试验

将待检菌株接种于LB固体培养基平板上，置37℃培养箱培养，24h时在培养菌落表面滴加Kovacs试剂3滴，在15s内观察结果看是否有颜色变化。

1.2.5 生化试验

1.2.5.1 糖发酵试验

将“1.2.1”中获得的疑似鸡白痢沙门氏菌的分离株用灭菌接种棒分别接种于含有葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖及卫矛醇的微量发酵管中，盲端向上30～45°角 放置，37℃培养24h培养观察。

1.2.5.2 MR试验

将“1.2.1”获得的疑似鸡白痢沙门氏菌的分离株用灭菌接种棒接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养72h，取出后于培养液中加入甲基红指示剂5滴，观察结果。

1.2.5.3 尿素酶试验

将“1.2.1”中获得的疑似鸡白痢沙门氏菌的分离株接种于尿素微量发酵管中，37℃培养24h培养观察。

1.2.5.4 吲哚试验

将“1.2.1”中获得的疑似鸡白痢沙门氏菌的分离株接种于生化蛋白胨水培养基中，置37℃培养24h培养观察。

1.2.5.5 鸟氨酸试验

将“1.2.1”中获得的疑似鸡白痢沙门氏菌的分离株接种于生化鸟氨酸微量生化管中，同时设置氨基酸对照管，上面加一层灭菌液体石蜡，置37℃培养24h，观察结果。

1.2.6 药敏试验

按照国外常用的Kirby－Bauer法（简称K-B法）进行。在无菌操作的条件下，将鉴定为细菌的纯培养物接种于缓冲蛋白胨水中，置于37℃温箱中培养24h，稀释菌液至0.5标准麦氏比浊管，用灭菌棉签蘸取稀释过的菌液并挤去多余的液体，在MHA平板上均匀涂布，盖上平板，置室温数分钟至培养基的表面无明显液体，用无菌小镊子夹取药敏纸片平贴于琼脂平板表面，然后翻转倒置于37℃恒温箱培养24h，测量抑菌环直径并判定结果。

本实验所选用的药敏纸片共有18种：氨苄青霉素（AMP）、羧苄青霉素（CAR）、阿莫西林（AMX）、头孢他啶（CAZ）、头孢噻肟（CTX）、链霉素（STR）、庆大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、壮观霉素（SPT）、环丙沙星（CIP）、恩诺沙星（ENR）、氟哌酸（NOR）、萘啶酸（NAL）、四环素（TCY）、氯霉素（CHL）、罗红霉素（RXT）、利福平（RFP）和磺胺甲噁唑（SMZ）。以抑菌圈直径的大小判断敏感性的高低，采用WHO质控标准菌的敏感性及抑菌圈大小划分方法报告结果,即敏感、中度敏感和耐药。药敏纸片种类及判定标准见表1。

表1 药敏纸片种类及判定标准（mm）

2 结果

2.1 细菌的形态观察

该分离菌在麦康凯培养基上长出无色、透明、细小圆形、光滑、湿润、边缘整齐及露滴状的菌落。在SS培养基上，形成无色透明圆形光滑菌落。在DHL培养基上，形成红色、圆形光滑细小菌落，如图1。在XLD培养基上，形成粉红色、圆形光滑菌落，如图2。在科玛嘉培养基上,形成紫色、圆形光滑湿润菌落,如图3。

图1 该菌株在DHL培养基上生长情况

图2 该分离菌株在XLD培养基上生长情况

图3 该分离菌株在科玛嘉培养基上生长情况

2.2 革兰氏染色镜检

在1000倍光学显微镜下，该分离菌菌株为两端钝圆、粉红色、革兰氏阴性杆菌，如图4。

图4 该分离菌菌株在光学显微镜下(1 000倍)

2.3 运动性检查

该分离菌在半固体中培养无刷状向外扩散现象，即无运动性。

2.4 氧化酶试验

该分离菌株培养物在加入Kovacs试剂后没有出现明显反应，判断该分离株的氧化酶试验结果为阴性。

2.5 生化试验

生化试验结果如表2。

该菌株能够发酵葡萄糖、甘露醇，产酸产气。不发酵乳糖、蔗糖、麦芽醇和甘露醇，鸟氨酸阳性，吲哚、尿素和MR试验为阴性。

2.6 药敏试验

药敏试验结果如表3。

如表3所示，该菌株对青霉素类的氨苄青霉素、羧苄青霉素、阿莫西林、喹诺酮类的萘啶酸、大环内酯类的罗红霉素、其他抗生素类的利福平和磺胺类的磺胺异噁唑完全耐药。对头孢菌素类的头孢他啶、头孢噻肟及氨基糖苷类的庆大霉素、卡那霉素和壮观霉素都敏感，其抑菌圈分别为：22mm、28mm、21mm、25mm和21mm。对氨基糖苷类的链霉素，喹诺酮类的环丙沙星、恩诺沙星、氟哌酸，酰胺酮类的氯霉素为中敏，其抑菌圈分别为：13mm、19mm、20mm、11mm和21mm。

3 分析讨论

（1）经上述鉴别培养、运动性观察、氧化酶试验、生化试验和药敏试验结果表明，该菌株为鸡白痢沙门氏菌。

3.2 关于选择培养

传统培养基的特异性较低，使对于沙门氏菌分离时常出现大量的假阴性。有研究表明，XLD和科玛嘉培养基在表现测试菌落敏感性和现场分离过程中对疑似菌落的筛选鉴别准确性明显优于WS、SS和HE培养基[6]。曾经有报导，XLD和科玛嘉培养基配合使用的敏感性达到100%[7]。XLD培养基又名木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐培养基，是以指示剂变化为原理的选择性培养基，可以用于分离临床标本中的肠道致病菌。该培养基含有的木糖、乳糖和蔗糖，有助于鉴别肠细菌，去氧胆酸钠能够抑制革兰氏阳性菌，酚红作为菌落酸碱指示剂，硫代硫酸钠和柠檬酸铁铵能使H2S阳性的肠细菌产生黑色菌落。鸡白痢沙门氏菌在XLD培养基上生长时，可见到淡红色湿润菌落。科玛嘉显色培养基是一种新型培养基，是酶底物显色型专一性沙门氏菌分离培养基，无需通过任何仪器，仅通过肉眼观察菌落颜色，即能对病原菌进行定性分析[8]。鸡白痢沙门氏菌在科玛嘉培养基上生长时，可见到呈现浅紫红色、圆形、光滑突起而湿润的菌落，特征明显，辨认比较便捷。鉴于上述原因，目前采用XLD培养基和科玛嘉显色培养基对沙门氏菌进行初步分离，可以明显提高阳性样品的分离效率，也大大减少了后期鉴定的工作量。

表2 该分离菌株生化试验结果

表3 该菌株的药敏试验结果

3.3 关于生化特性鉴定

鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门氏菌在生化特性方面的相同点多于不同点。2者都可以发酵阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、鼠李糖和木糖，产酸、产气或不产气。不发酵乳糖、蔗糖。2者细菌的生化特性的重要区别是，鸡伤寒沙门氏菌发酵卫矛醇而鸡白痢沙门氏菌不发酵；鸡白痢沙门氏菌培养可以迅速使鸟氨酸脱羧，而鸡伤寒沙门氏菌则不然。

3.4 药敏试验

在药敏试验中，该菌株对氨苄青霉素、羧苄青霉素、阿莫西林、萘啶酸、罗红霉素、利福平和磺胺异噁唑完全耐药；对链霉素、环丙沙星、恩诺沙星、氟哌酸和氯霉素为中敏；对头孢他啶、头孢噻亏、庆大霉素、卡那霉素和壮观霉素都敏感。以往由于临床中养殖场用药的差异等因素，使得各地区、各养殖场鸡白痢沙门氏菌的耐药谱呈现很大差异[9]。

另外，尚应当注意，即使经药敏试验筛选出了一些敏感药物用于临床鸡白痢的防控，效果并不见得理想，此时，一要考虑是否混合感染大肠杆菌等其他病原[10]，二要注意药物体外与体内作用环境不同等问题，在实际用药选择上应作更多科学、全面的考虑。

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