鸭肝炎病毒对雏鸭脑组织损伤的研究

刘承军 李 营 王海丽

（1聊城市动物医院 山东聊城 252000 2聊城职业技术学院 山东聊城 252000）

鸭病毒性肝炎是由I型鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种急性传染病，该病发病急、传播快及死亡率高[1]。1980年至今，鸭病毒性肝炎在我国多次暴发，且发病严重，流行区域广、造成巨大损失，给养鸭业带来巨大经济损失。本文针对鸭肝炎病毒人工感染雏鸭出现的明显神经症状，对神经系统进行病理组织学研究和分子生物学的研究，采用人工复制鸭病毒性肝炎模型，动态取材脑组织，普通组织固定和HE染色，脑组织中NO和MDA含量的测定等方法，分析临床症状、组织学病变与组织NO、MDA含量之间的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

752紫外可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、NO试剂盒（南京建成生物有限公司）、MDA试剂盒（南京天成生物科技有限公司）、离心机（上海化工机械）、切片机（上海化工机械）。

1.2 毒株

接种材料I型鸭肝炎病毒（DHV-1）由华中农业大学病理实验室保存。毒株的复壮过程为：接种敏感、抗体阴性的健康樱桃谷鸭5只，每只腿部肌肉注射0.2mL。收集死亡鸭的肝脏进行匀浆，5倍生理盐水稀释，加双抗（青霉素、链霉素），过滤后-20℃保存备用。

1.3 实验动物

50羽1日龄鸭肝炎抗体阴性的健康樱桃谷鸭，购自武汉市天绿农业科技有限公司，常规饲喂正大牌肉鸭料，自由饮水采食。4日龄后随即分为2组，每组25羽，其中第一组为对照组，另外一组为试验组。在试验过程中死亡的鸭，及时取材脑组织，用于HE染色。

1.4 方法

1.4.1 人工感染模式的复制及取材

试验组雏鸭进行腿部肌肉注射DHV-I病毒悬液0.2mL/羽，对照组25只，相同部位注射等量生理盐水。饲养于隔离器内。观察期临床症状，并与感染后0、3、6、12、24和48h按照3羽/组进行静脉放血处死，剖检观察病变，采集脑组织，1份甲醛固定用于石蜡切片制作，常规的HE染色；另一份研磨制成10%脑匀浆，用于NO和MDA浓度等的测定。

1.4.2 脑匀浆的制备

滤纸吸干脑组织表面的血液，准确称取1g脑组织块，用冷生理盐水冲洗，加入10mL冰冻磷酸盐缓冲液（pH7.2），制成100g/L组织匀浆，3000r/min离心15min，取上清液，-20℃保存待用。

1.4.3 测定方法

MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法；NO浓度利用硝酸还原酶特异性将硝酸根还原为亚硝酸根，通过显色深浅测定。所有试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。

1.4.4 数据处理数据结果均以平均数表示，用t检验法分析对照组和试验组间的差异显著性。

1.4.5 脱水及染色严格按有关程序对组织块脱水及HE染色。

2 结果及分析

2.1 临床变化

临床观察发现，对照组鸭没有发现特征性表现，在攻毒24h后，试验组雏鸭表现呆滞，离群独立，行动迟缓，精神沉郁，垂翅缩颈，部分鸭出现抽搐和运动失调等症状；48h时部分雏鸭死亡，并于攻毒后72h全部死亡，死鸭呈典型角弓反张状态，剖检发现，肝脏肿大、质脆、色暗或发黄，表面有大小不等的斑点状出血；雏鸭的大脑、肾脏、脾及胰腺的表面有点状或块状出血，肠黏膜肿胀、充血。

2.2 组织病理学变化

图1 感染雏鸭大脑病理变化（感染3小时后，血管水肿）

图2 感染雏鸭大脑病理变化（感染3h后，神经元坏死）

图3 感染雏鸭大脑病理变化（感染24h后，脑膜下充血）

图4 感染雏鸭大脑病理变化（感染24h，神经元坏死）

图5 死亡雏鸭脑组织病理变化（神经元坏死后的小胶质细胞结节）

图6 死亡雏鸭脑组织病理变化（血管周围淋巴细胞浸润）

图7 感染雏鸭脑组织病理变化（感染80h后，典型的坏死灶）

大脑于攻毒后3h出现轻度水肿(图1)，3h到12h出现个别神经元死亡和血管淋巴细胞浸润（图2、图4）。24h神经细胞和血管周围出现明显的水肿，血管充血并见轻度出血（图3），48h后及死亡鸭只的脑组织，胶质细胞呈局造型增生，神经元形成坏死结节（图5），血管周围淋巴细胞浸润（图6），出现典型的神经元坏死病灶（图7）。

对照组神经组织如大脑、小脑等基本正常，偶尔见有轻度充血和水肿。

2.3 NO、MDA测定结果

表1 脑组织中NO、MDA含量的测定结果（n=3）

试验组雏鸭脑组织中NO含量测定结果见表1。脑组织中NO含量在接种后12h开始逐步升高，48h到达测定最大值，随后雏鸭开始死亡。脑组织中MDA含量从12h开始逐步增高，到48h达到测定最大值，和脑组织中NO含量变化一致。对照组脑组织中NO和MDA含量均变化不显著。这2项数据的一致性可以一定程度反映出，随着NO含量的增加，脑组织过氧化反应也在加剧，脑组织损伤不断推进。

2.4 结论

试验组雏鸭临床症状和剖检病变及组织学病理变化相一致，可以一定程度反映出脑组织病变和雏鸭神经症状之间的关联程度。经过脑组织中NO和MAD的测定显示，NO含量随时间的变化规律和MDA随时间的变化相一致，可以反映出NO在脑组织病变中发挥了一定作用。纵向来看，NO在雏鸭病毒性肝炎的发生、发展的过程中发挥了一定作用；NO可能是雏鸭出现神经症状和脑组织病变的原因之一。

3 讨论

自由基是机体正常生化过程的产物，参与生物体许多病理、生理过程[2]。正常情况下，自由基的产生与清除保持着动态平衡。任何增强氧化作用和（或）降低抗氧化能力的因素均可打破这一平衡，致氧自由基增加。试验结果表明，氧自由基可以介导脑组织的损伤，导致疾病的发生、发展。生物体内的自由基，与过氧化氢反应所产生的羟自由基可引发脂类过氧化，导致细胞损伤，使细胞膜破坏，通透性增加，蛋白质及DNA变形[2]。

有研究结果表明，鸭肝炎病毒对雏鸭神经组织的损伤，早期以水肿为主，后期以变形、坏死增生为主，与本试验结果相同。

PUFA在ROS的作用下，可在不饱和双键上不断发生过氧化反应，MDA为脂质过氧化的最终产物之一，它可反映脂质过氧化的程度，间接反映自由基变化程度。本试验结果表明，脑组织中MDA含量随着时间的发展不断增加，且在攻毒后48h时含量最高，脑组织中的MDA含量增加规律同鸭的临床症状和组织学病变的发展规律一致，一定程度上反应了组织损伤的发展规律，同时也验证了脑组织的损伤一定程度上是由自由基反应引起的。

NO是常见的炎症介质。研究表明，NO参与了各种原因引起的组织损伤，既有保护性作用，又有细胞毒性作用。NO生成过多，将通过机体内蛋白质、脂肪和核酸等生物分子的作用，损伤组织细胞，对机体产生毒性作用。试验组脑组织中NO含量随着时间的增加而不断增加，表明NO在疾病发生发展过程中扮演了重要的角色，在脑组织损伤方面发挥了一定的作用。NO作为一种重要的自由基，在脑组织生理、病理方面都扮演了重要的角色；MDA作为自由基脂质过氧化反应的一种重要产物，其测定从反应细胞膜损伤方面具有一定意义[3]。但是NO和MDA之间具体的量化关系尚不明确，NO引起脑组织细胞其他方面的病变（比如增生、核酸和蛋白质损伤）尚不明确，需要我们进一步研究。

[1]王丙云,黄兴国,陈志胜,等.雏鸭感染鸭病毒性肝炎后神经系统的动态病理学观察[J].中国兽医杂志，2003(1)：14-15.

[2]郑艳华,胡薛英,程国富,等.感染新型鸭肝炎病毒雏鸭的SOD活性和MDA含量变化[J].中国兽医科技，2004(12),6-9.

[3]丛涛,赵霖,鲍善芬.临床营养学研究中脂质过氧化的评价方法 [J].中国临床营养杂志，2004(2)：127-131.