HG-FAAS法测定雄黄染毒小鼠肝及肾脏中的砷含量

苑 洁，霍韬光，王艳蕾，郭婧潭，焦雪鑫，张颖花，袁 媛，高岚岳，姜 泓

(中国医科大学 公共卫生学院，辽宁 沈阳 110013)

HG-FAAS法测定雄黄染毒小鼠肝及肾脏中的砷含量

苑 洁，霍韬光，王艳蕾，郭婧潭，焦雪鑫，张颖花，袁 媛，高岚岳，姜 泓*

(中国医科大学 公共卫生学院，辽宁 沈阳 110013)

建立了氢化物发生-火焰原子吸收法(HG-FAAS)测定雄黄染毒小鼠肝及肾脏中砷含量的方法. 结果表明，该方法准确、灵敏、可靠、检出限低. 雄黄染毒小鼠肝、肾脏中砷的分布水平相当. 同时对氢化物发生条件进行了优化.

氢化物发生-火焰原子吸收法；雄黄；砷

雄黄作为含砷中药，被《医疗用药毒性药品管理办法》归入28种毒性中药之一，因其具有解毒杀虫、燥湿祛痰和截疟的功效[1]，因此在很多中成药制剂包括一些名方(如安宫牛黄丸、牛黄解毒片、小儿至宝丸等)中含有雄黄. 临床上因不规范(超量或长时间)服用含雄黄中成药而发生的中毒事件时有报道，其临床表现为全身多系统损害，以肝脏和肾脏损害为主[2-3]. 雄黄及其复方的安全性问题受到了国内外医学界的质疑，影响了含雄黄中成药的国际声誉，由此引发的雄黄对人体健康的影响已成为人们关注的焦点.

目前，测定生物样品中总砷含量的方法主要有电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)和原子荧光法(AFS)[4-5]，氢化物发生-火焰原子吸收法(HG-FAAS)测定生物样品内总砷的含量则鲜有报道. 本文作者建立了HG-FAAS测定雄黄染毒后的小鼠的肝及肾脏中砷水平的方法，同时考察了氢化物发生条件，并运用此法对雄黄中砷在小鼠肝及肾脏中的分布进行了初步研究.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

氢化物发生-火焰原子吸收分光光度计(日本日立公司)、超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)、Easypure纯水系统(美国Barnstead公司). 雄黄、亚砷酸钠、羧甲基纤维素钠盐、氢氧化钠、硼氢化钠、碘化钾、无水乙醚、硫酸，均为市售优级纯或分析纯试剂.

1.2 实验动物分组及染毒

SPF级雄性昆明小鼠30只(中国医科大学实验动物部提供)，体重(20±2) g. 饲料环境条件：室温保持(24±1)℃，相对湿度控制在(50±5)%，室内人工照明(12 h光/暗循环，光照时间为6:00～18:00). 小鼠采用标准饲料喂养，自由摄食及饮水，在实验前适应性饲养1周. 按照体重分层随机分为3组，每组10只. 以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液为混悬介质，第1组为对照组(0.5% CMC-Na水溶液)，第2～3组分别为低、高剂量雄黄染毒组，分别灌胃给予雄黄混悬液0.05和0.5 g/kg. 灌胃每日1次，每隔3天称量体重1次. 调节灌胃剂量，共染毒8周.

1.3 样品采集及处理

于末次给药2 h后，使用无水乙醚麻醉，断头，冰浴条件下取肝及肾脏组织，用0.9%生理盐水冲洗干净，待用.

1.4 方法学考察

1.4.1 标准曲线与检测限

取对照组平行样混合组织消化液(X液)350 μL，加入350 μL 砷标准对照液，得相当于浓度为0、5、10、15、25、50和100 μg/L的砷组织样品，按样品处理项处理后，进入HG-FAAS分析. 以组织样品中砷浓度为横坐标，相应的原子吸收吸光度值为纵坐标，用最小二乘法进行回归计算，求得直线的回归方程，即为标准曲线.

1.4.2 精密度与准确度

取X 液350 μL，加入350 μL 砷标准溶液，得浓度为10、35和70 μg/L的砷质控(QC)样品，每个浓度制备6个模拟样品，以标准曲线计算QC样品的测得浓度，与配制的浓度对照，求得本方法的准确度与精密度.

1.4.3 回收率

取 QC样品，每一浓度制备6个模拟样品. 另取X液350 μL，加入350 μL去离子水，得空白样品，同法测定. 方法的回收率=(测得的质控样品浓度-测得的空白样品浓度)/加入的砷标准溶液浓度.

1.5 肝及肾脏中砷含量的测定

分别准确称取小鼠的肝及肾脏组织100 mg，加入1 mL去离子水，超声破碎2 min；再加入1 mL 3 mol/L硫酸，混匀，微波消解10 min，室温放置过夜；第二天加入1 mL去离子水，3 000 rpm离心15 min，取上清液为组织消化液. 取干净试管加入1.4 mL 1%硫酸，再加入0.7 mL 0.2 mg/L碘化钾溶液，混匀后加入700 μL组织消化液，最后加入4.2 mL去离子水，混匀，待测.

将上述制备的溶液注入HG-FAAS中检测砷含量，检测波长为193.3 nm.

1.6 统计分析

所得数据以平均值±标准差表示，用SPSS17.0软件单因素方差分析方法(ANOVA)进行各指标组间差异的显著性检验，以P<0.05作为检验的显著性差异.

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 标准曲线及检测限

由表1可见，在10～100 μg/L浓度范围内r>0.99，表明线性关系良好. 采用逐级稀释法稀释砷标准溶液，在10 μg/L时信噪比(S/N)大于3，因此确定砷的检出限为10 μg/L.

表1 样品中砷的标准曲线、线性范围及相关系数

2.1.2 精密度、准确度及回收率

由表2可见，我们建立的HG-FAAS砷分析系统的灵敏度高、准确性好、回收率高. 两种脏器中砷的加标回收率在93.5%～98.5%之间，RSD<5%，RE在2.3%～-6.6%之间.

表2 方法的加标回收率与精密度(n=6)

2.2 肝及肾脏中砷含量的测定

由表3可知，随雄黄染毒剂量的增加肝及肾脏中砷水平逐渐升高，与对照组比较有显著性差异(P<0.01).

表3 雄黄染毒小鼠肝及肾脏中砷含量±s，n=10)

注：*表示与对照组比较，P<0.01

2.3 氢化物发生条件的优化

硼氢化钠在酸性溶液(硫酸)中产生新生态的氢，它能将样品中的砷还原成砷化氢气体，所生成的砷化氢在载气(氩气)的带动下进入原子化器；而样品中的其他成份基本不发生反应，被留在废液中，由此造成砷与其他基质的分离. 无机砷以三价和五价两种价态存在，而五价砷不易形成砷化氢，直接用硼氢化钠还原不完全，会造成测试结果偏低. 故在测定砷时选择0.2 mg/L碘化钾溶液为预还原剂.

H2SO4载流的流速和酸度均影响样品的载带速度、氢化物发生效率以及原子化火焰状态. 本文作者考察了不同酸度和流速的H2SO4对砷分析的影响，实验中采用10 mL/min的载流流速和1%的H2SO4载流酸度，结果表明检测具有较高的灵敏度.

NaBH4的浓度和流速可影响被测元素的氢化物发生效率，进而影响测定的灵敏度，因此本文考察了不同浓度和流速的NaBH4对原子化的火焰状态和分析测定的精密度和稳定性的影响. 实验选用10 g/L的NaBH4溶液和8 mL/min的流速，结果表明，火焰状态稳定，基线平稳，信噪比较好.

2.4 雄黄与药源性砷中毒

雄黄最早收载于《神农本草经》中，是传统中医的常用药，为很多成方所采用, 亦可单独采用. 现代医学研究表明，含雄黄的复方制剂或单方在治疗白血病和癌症等恶性疾病方面也有不错的疗效[6]. 此外，有研究表明, 雄黄有望用于治疗胶质瘤[7]. 由于此类药物的临床应用广泛、疗效确切, 成为许多家庭的常备药物. 甚至与西药相比，人们通常认为中药无毒/副作用，可以强身健体，因此往往未在医生严格指导下服用，而是随意增加药量、延长用药时间等，导致长期、大量使用含雄黄制剂，由此可能造成药源性慢性砷中毒. 动物实验进一步证明雄黄的毒性大小与体内砷的蓄积量密切相关，砷摄入剂量稍大或长期少量摄入，致使体内蓄积到一定程度均可引起中毒[8]. 因此，建立准确、灵敏的生物样品中砷含量的检测方法是研究雄黄及其复方制剂引起的药源性砷中毒机制的前提，本研究所建方法为深入研究雄黄及其复方制剂的“时间-剂量-毒/药效-机制”关系提供帮助.

3 结论

建立的HG-FAAS方法适用于小鼠肝及肾脏中砷含量的测定. 该方法准确、灵敏、可靠、检出限低.

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[S]. 北京： 中国医药科技出版社， 2010: 316.

[2] 马斌， 李彤， 姜泓. 我国雄黄及其复方的毒副作用研究进展[J]. 中华中医药学刊， 2013， 31(8): 1623-1625.

[3] 夏薇， 方芳， 赵余庆. 长期超量应用雄黄及其制剂引起的药源性慢性砷中毒探析[J]. 亚太传统医药， 2009， 5(4): 143-146.

[4] 汤家铭， 谷颖敏， 李咏梅， 等. 雄黄灌胃给药后砷在孕大鼠脏器内的分布及排泄途径研究[J]. 中国中医药信息杂志， 2012， 19(8): 34-37.

[5] 李春英， 梁爱华， 王金华， 等. 雄黄砷的蓄积性研究[J]. 中国中药杂志， 2011， 36(14): 1895-1899.

[6] 王晓波， 张治然， 袭荣刚. 雄黄等砷剂治疗白血病的机理及临床应用[J]. 解放军药学学报， 2003， 19(2): 129-132.

[7] 庞琦， 王文斌， 葛明旭， 等. 雄黄治疗胶质瘤的初步试验研究[J]. 山东大学学报: 医学版， 2006， 44(4): 376-379.

[8] 梁爱华， 李春英， 王金华， 等. 雄黄的毒性研究[J]. 中国中药杂志， 2011， 36(14): 1889-1894.

[责任编辑：任铁钢]

Determination of arsenic in liver and kidney of mice exposed in realgar by HG-FAAS

YUAN Jie, HUO Taoguang,WANG Yanlei, GUO Jingtan, JIAO Xuexin, ZHANG Yinghua, YUAN Yuan, GAO Lanyue, JIANG Hong*

(SchoolofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110013,Liaoning,China)

A novel hydride generation-flame atomic absorption spectrometry (HG-FAAS) method was established for the determination of arsenic in liver and kidney of mice after realgar exposure. The results showed that the method was accurate, sensitive, reliable and low detection limit. The distribution levels of arsenic in liver, kidney of realgar infected mice were fairly with the liver and kidney content. Meanwhile hydride generation conditions were optimized.

HG-FAAS；realgar；arsenic

2014-11-04.

国家自然科学基金资助项目(81473417；81403066).

苑 洁(1989-)，女，硕士生，研究方向为中药毒/药效作用物质基础及机制.*

，E-mail：jianghong@mail.cmu.edu.cn.

O657.7

A

1008-1011(2015)01-0061-03