植物酯酶应用于有机磷农药残留分析技术的研究进展

2015-03-26刘彦钊席会平

化学研究 2015年1期

刘彦钊，席会平，江飞

（1.河南质量工程职业学院，河南平顶山 467000；2.武汉理工大学资源与环境学院，湖北武汉 430070）

随着我国农业的高速发展，农药的环境污染问题越来越严重，由此带来很多的问题.人体摄入的硝酸盐有81.2%来自受农药污染的蔬菜，而硝酸盐是国内外公认的致癌物亚硝胺的前体物，长期食用会导致癌症、动脉硬化、心血管病、胎儿畸形、死胎、早夭、早衰等疾病.绝大多数人食用有害蔬菜后并不马上表现出症状，毒物在人体中富集，时间长了便会酿成严重后果.一个值得注意的倾向——近年来，癌症的发病率越来越高，且日趋年轻化，这在很大程度上与食用受污染蔬菜有关.如何检测与控制农药在食品中的残留成为一个关系到国民健康的重要问题.

目前我国使用的农药主要种类为有机磷农药.而有机磷农药残留分析技术有气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、色谱/质谱联用技术（GC/LC-MS）、毛细管电泳法（CE）、酶抑制法、免疫分析法（Immunoassay，IA）、生物传感器法和速检法等［1］.GC、HPLC、GC/LC-MS具有高选择性，但是操作繁琐、耗时长、成本高、并且要求对样品进行预浓缩和衍生处理，难以得到广泛的应用［2-3］.而成本相对低廉的酶抑制法、免疫分析法、生物传感器法等方法则具有比较广阔的应用前景［4-5］.

最早发展起来的酶分析技术采用的酶基本是从动物如果蝇或电鳗中提取的［6］.但是，动物酯酶提取困难而且保存条件苛刻.相对来说，植物酯酶来源广泛，提取容易且易于保存［7］.

1 植物酯酶的酶源

由于植物酯酶的活性受酶源的影响较为明显，如酶源的品种、批次等都会对检测结果的重现性产生影响，所以有必要研究植物酯酶的酶源.

康天放等［8］采用离心提取法从四种小麦中提取了粗酶液，并采用分光光度法测定了植物酯酶的催化效率.结果表明，不同品种植物种子的酯酶对有机磷农药的敏感度有所不同.在研究的四种小麦中，以京2小麦最适合用于对硫磷的分析，检测的最低限值可以达到3.0×10-7mg/L.

雷明等［9］对不同来源的12种植物材料进行了植物酯酶的提取和分析，以筛选出高活性的酶源.研究发现，在所有材料中以花豇豆的酶活力最强，明显比其他酶源得到的酯酶活性要好.为了进一步了解花豇豆酯酶的活性，作者用花豇豆酯酶进行了6种农药的检测，检测结果表明，采用花豇豆酯酶进行分析检测，最低检测限均小于国家规定的范围，非常适合于植物酯酶抑制法的分析，其酯酶的总活力、比活力、活力及其敏感性在所实验的十几种植物中是最为理想的.

阮长青等［10］从同一植物的不同材料，同一材料的不同部位及同一部位不同生长期的植物体中提取了植物酯酶，并对这些酯酶的活力进行了研究，发现种子一旦发芽或长成幼苗，则其酯酶活性迅速下降.他们同时研究了不同植物种子酯酶的活性，并结合对同一种子的不同部位提取的植物酯酶进行横向对比，最终证实龙麦26号小麦的种子中的麸片提取的酯酶的活性最高.

王亚飞等［11］对多种不同来源的植物酯酶进行了筛选研究，发现花豇豆总酯在有机磷农药残留分析中具有活性高、灵敏度好的特点，花豇豆可以作为一种理想的植物酯酶来源植物.

刘洋等［12］从马铃薯、红薯、茨菇、芋头四种块茎植物中提取植物酯酶，并将自制的植物酯酶运用到酶抑制法分析有机磷农药的研究中，结果表明四种不同来源的植物酯酶在有机磷农药残留分析中均有比国家检测标准更高的灵敏度，适宜于作为有机磷农药残留检测用酶.

不同种属的植物的不同部位均可以进行植物酯酶的提取.但是，酶源的活性影响因素较为复杂.不同种属植物制得的酯酶活性不同，同一种属但不同品种活性也不相同，同一种属同一品种不同部位活性也不相同，即便以上都相同，制备方法不同其活性也会有差异.总的来说，植物酯酶源种的活性研究还处于摸索阶段，只能发现现象，对实验现象的解释还不够.所以目前植物酯酶源种研究的一个重要方向是寻找植物酯酶活性的普遍规律以指导植物酯酶源种的选择.若能完善相关理论，则必能找到一种超高活性植物酯酶的源种，而植物酯酶的灵敏度、检出限都将会被优化，在有机磷农药残留分析领域的应用前景将会更加广阔.

2 植物酯酶的提取、纯化及固化工艺

植物酯酶的提取工艺直接关系到酶的活性以及在酶抑制分析中的灵敏度，而酶的纯化则有利于提高酶的活性.固化工艺则可以使酶固定化，便于储存和使用，非常适合于现场快速分析.

2.1 植物酯酶的提取工艺

多数文献中植物酯酶提取方法往往采用离心分离法.在离心分离时要根据欲分离物质以及杂质的大小、密度和特性的不同选择适当的离心机.而离心机有常速（≤8 000r/min）、高速（10 000～25 000 r/min）、超高速（25 000～80 000r/min）之分，所以使用离心分离法进行植物酯酶提取时应进行转速的合理选择.然而，目前离心分离转速选择对酶活性的影响还未见有研究.此外，超高速离心机可以进行植物酯酶的纯化，不过目前还未见有国内文献使用此方法.

李绍中等［13］根据盐溶液提取法的原理，研发了一种从小麦中提取植物酯酶的新工艺.他们发现，在提取的过程中加入适量呈电中性的盐类物质可以显著提高酶的溶解度和活性，他们采用新的实验方法优化了提取工艺，得到提取酯酶的最佳条件：采用含NaCl的溶液作为提取剂，提取温度为4℃，提取时间为60min.

王振宇等［14］研究了提取小麦酯酶的工艺.根据Box-Behnken中心组合实验设计原理研究了盐浓度、时间和温度等条件，在此基础上建立了小麦酯酶后行的二次回归模型，并得出了该工艺的最佳条件：盐浓度为0.164mol/L，温度为37.27℃，提取时间101.21min.

王亚飞等［15］研究了从苜蓿中提取植物酯酶的工艺方法，并考察了提取条件对酯酶活性的影响.结果表明，最佳的提取条件：缓冲溶液为0.1mol/L磷酸盐，pH＝7.0，温度为40℃.

酶的提取方法对酶的活性影响很大，如采用有机溶剂提取法会使酶的活性严重损失.故研究出便捷、酶存活率高、成本低的提取方法至关重要.常见的酶的提取方法有盐溶液提取法、有机溶液提取法、酸溶液提取法、碱溶液提取法和离心分离法等.其中有机溶液提取法酶活性较低，多不采用；酸碱溶液提取法适用范围较窄，所以一般采用的是离心分离法和盐溶液提取法.

2.2 植物酯酶的纯化

植物酯酶的纯化工艺主要有筛膜分离法、选择性沉淀法、电泳分离法、选择性热变性法、亲和层析法和聚焦层析法等.

周艳明等［16］研究了层析工艺在植物酯酶纯化中的应用.他们采用了Q-Sepharose-Fast Flow阴离子层析法进行纯化，纯化倍数高达16.814倍.同时采用葡聚糖G-200薄层凝胶层析法及高效液相色谱证明了纯化效果，并确定了此法的最佳操作条件.

温艳霞等［17］以磷酸缓冲液提取了大豆的植物酯酶.采用离心分离、盐析纯化、离子交换层析纯化等方法得到了高纯度的大豆酯酶.他们研究了该大豆酯酶的活性最佳条件：温度30℃，pH＝7.5；同时发现大豆酯酶的活性随离子强度的改变而发生变化.

徐礼鹏等［18］提出了在植物酯酶纯化工艺中应用超滤膜技术，证明了超滤膜技术应用于纯化植物酯酶工艺的可行性.

植物酯酶提取之后的粗酶液中除了含有目标酶之外往往还存在着很多杂质，包括大分子的核酸、其他蛋白质、以及一些小分子物质.进行纯化可以除去这些杂质，从而使酶的活性得以提升，这有利于进一步提高植物酯酶在有机磷农药分析时的灵敏度.植物酯酶纯化方法虽然多种多样，但是较常使用的有盐析法、非离子型聚合物沉淀法、凝胶层析法、亲和层析法和电泳法等.由于粗酶液中的成分较复杂，进行纯化时单独采用某一种技术往往效果不是特别理想，而常采用上述方法的组合，如含有的核酸可以使用硫酸鱼精蛋白进行沉淀然后低温离心除去，粘多糖多采用离子型表面活性剂进行去除，而小分子物质可以采用过滤法去除等.

2.3 植物酯酶的固化

游离态的酶具有稳定性差、无法重复使用、混入产品中难以分离等缺陷.为了克服这一缺陷，发展出了模仿人体酶的作用方式将酶进行固定化的技术，并且酶固定化之后仍保持了酶的高催化性.因此，上个世纪60年代后期，酶固定化技术迅速地发展起来.虽然酶的固定化技术发展迅速，但是到目前为止真正能投入工业生产的固定化酶只有为数不多的十几种，故酶固定化技术还需进一步的研究和发展.

周艳明等［19］采用冷冻干燥法对植物酯酶进行固化，最终将酯酶制成了干粉.他们对固化工艺条件进行了研究.研究结果表明，酶液厚度过大会使干燥时间延长，但是对酶的活力并没有显著的影响；而在冷冻干燥固化的过程中向酶液中添加5%的聚乙二醇可对酶进行保护，防止其失活.

许娟等［20］利用硝酸纤维素膜（NC）对植物酯酶的固定化进行了研究，探讨了固化过程工艺条件的优化，并研究了固定化之后的植物酯酶对四种农药残留的敏感性.固化过程工艺条件为：游离酶20 μL，浓度为0.05%的戊二醛溶液2μL，最佳酸度7.0，采用缓冲溶液稳定该溶液的pH，最佳温度4℃，在此条件下固定8h即得到固定化酶片.该固定化酶片的最佳活性条件：温度35℃，pH为8.0，均高于游离态的粗酶液.最后将游离态酶液与固定化酶的敏感性进行了对比研究，发现在检测4种农药时，固定化酶的敏感度均高于游离态酶的，他们认为，固定化酶比游离态的酶液更适合于农药的快速检测.

明雪杰［21］以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）为单体，N，N′-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，甲醇水溶液为致孔剂，采用悬浮聚合法制备了GMA-NVP-MBA多孔聚合物微球，并将该微球作为载体应用于植物酯酶固定化工艺中.结果表明，该载体在植物酯酶固定化中十分具有优势，具有广阔的应用前景.

植物酯酶用于农药残留检测中存在一个很突出的问题.虽然其价格低廉、制备简单、适合现场操作，但是若均采用酶液进行分析则存在着存储不方便的问题，这将制约植物酯酶在农药残留检测中的应用.所以固定化酶是今后植物酯酶应用的一个最重要的途径.若制成固定化的检验盒，并能投入工业化生产，则将成为一个快速、便捷、高效的检测手段.

3 植物酯酶应用于农残分析的方法

目前基于植物酯酶的分析方法主要有酶抑制法和生物传感器法.

3.1 植物酯酶分光光度法

近年发表的基于酯酶抑制的分光光度法的研究文献占到了植物酯酶应用的绝大部分.

于基成等［22］依据植物酯酶抑制的原理，采用显色分光光度法研究了一种有机磷农药残留快速检测方法，确定了检测时的最适宜条件，在此基础上，以聚苯乙烯反应板为载体进行有机磷农药的快速检测，最低检测限为0.245μg.

邱会东等［23］采用α-乙酸萘酯为底物，三氯化铁溶液为显色剂，在植物酯酶的作用下α-乙酸萘酯发生水解生成萘酚和乙酸，而萘酚遇到三氯化铁可进一步与之化合生成紫色络合物.由于植物酯酶的活性可受到微量有机磷农药的抑制，故若样品存在微量残留有机磷农药则会使水解程度变小，从而使萘酚生成量减少，溶液的紫色变浅.作者详细研究了各种因素对检测反应的影响.通过5种农药的检测，验证了此法的可行性，他们认为，该法在农药残留量于0.001～0.250mg/L范围内，相对偏差较小，分析精度较高，而加标回收实验验证此法的加标回收率可以达到87%～93%.

王亚飞等［24］根据植物酯酶抑制原理，以2，6-二氯乙酰靛酚为显色剂，建立了一种快速检测蔬菜中有机磷农药残留的方法，通过对反应条件的研究确立了检测方法的最佳条件.他们采用此法对5种有机磷农药残留进行了详细的分析，分析知该法的最低检测限范围为0.002～0.05mg/L.

赵永福等［25］将植物酯酶抑制原理与荧光分光光度法结合建立了一种新型的分析方法.该法中采用乙酸-1-萘酯为底物，以植物酯酶催化底物分解产生一种荧光物质——萘酚.在该反应体系中加入β-环糊精可增强萘酚的荧光强度，从而使分析的灵敏度得以提高.该法的线性相关系数高，说明此法的精度比较高，可以作为植物酯酶抑制分光光度法的一个补充.

朱秋兵等［26］介绍了酶抑制分光光度法在基层检测蔬果农残中的应用及基本原理，比较了国家标准与行业标准的异同，阐述了酶抑制分光光度法的前处理及分析注意事项.

潘建文［27］简述了酶抑制分光光度法目前在农药残留分析中的应用，分析了此法的优势及需要注意的问题.

刘亚平等［28］对本地多种蔬菜中的4种农药残留量进行了植物酯酶抑制分光光度法分析，结果表明，植物酯酶抑制分光光度法对氧化乐果检测灵敏度低，对敌百虫、呋喃丹、毒死蜱检测灵敏度高.

目前国内在进行植物酯酶抑制法测定农药残留时，除了赵永福在文献［25］中采用荧光分光光度法分析之外，多数采用与紫外-可见分光光度计联合使用，并且使用的酶多采用未经固化的粗酶液.但是，粗酶液不易保存，且分光光度计不易携带，故不利于现场检测的开展.

3.2 植物酯酶生物传感器法

酶传感器是最早出现的生物传感器.1962年CLARK等提出了酶传感器原理，1967年UPDIKE等依据这一理论制成了酶电极，将酶电极与酶固定化技术相结合制成的传感器称为酶传感器.

栾崇林等［29］采用溶胶凝胶法将植物酯酶包埋在凝胶中，干燥之后得到有机磷的传感膜.将此膜与光纤器件耦合得到一种有机磷光纤生物传感器.以此传感器对7种有机磷农药进行基于酶抑制原理的分析检测，结果表明，此植物酯酶生物传感器对0.010～10.000mg/L浓度范围内的农药残留具有较高的分析精度，回收率较高，相对标准偏差较小，且检测过程稳定不易受干扰.此传感器可以应用于有机磷及氨基甲酸酯的现场检测.

姜彬等［30］采用离心分离法从小麦中提取了植物酯酶，纯化之后作为生物传感器的酶源.以四氨基铜酞菁/单碳纳米管/GC修饰电极为基体电极，采用气相沉积法制备得TiO2凝胶，将植物酯酶包埋入此凝胶中，干燥后即制得植物酯酶生物传感器.具有诸多优点，精确度高，且检测下限较低，有较强的实际应用价值.

朱赫等［31］介绍了近年来农药残留快速分析用酶生物传感器的类别，主要包括胆碱酯酶、酪氨酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、过氧化物酶、有机磷水解酶和谷胱甘肽巯基转移酶等，可直接用于农药残留的快速检测.

4 植物酯酶抑制法实验条件的研究

目前植物酯酶抑制法多采用的酶是粗酶液，酶液中成分复杂，并且游离态的酶稳定性差，实验条件的细微改变就会导致活性的很大差别，从而影响到分析的结果.也正因为如此，国内文献中对于植物酯酶抑制法实验条件优化的研究层出不穷.

栾崇林等［32］采用均匀设计法对植物酯酶抑制法测定有机磷农药残留的检测条件进行了优化，通过7种农药的测定，确定了最佳的反应条件，并通过检测蔬菜样品中农药残留验证了最佳条件.

张宁［33］采用两种不同的固定方式对植物酯酶进行固化处理，对比了不同固化方式对固化酯酶敏感度的影响.他们将固化酯酶应用于农药残留的实验条件进行了优化.得出以下结论：固化方式以离子交换法为好，而固化酶在检测中的最佳pH为4.8，最适宜温度与游离酶相当，固化酶活力受温度影响较为显著.

赵永福等［34］测试了5种表面活性剂对植物酯酶抑制分析中显色反应的増敏作用.确定十二烷基硫酸钠（SDS）对分析中的显色反应的増敏作用可达到70%，同时对影响显色反应的因素进行了研究.

黄保宏等［35］研究了温度对植物酯酶的影响规律，发现温度对酶活性影响比较显著，并确定了植物酯酶的最佳活性温度为45℃.

刘春红等［36］研究了以α-乙酸萘酯和固蓝B盐为显色体系的酯酶活力的最佳反应条件，在α-乙酸萘酯浓度为0.015mol/L时，最佳pH为6.5，最佳温度为40℃，最佳抑制剂浓度为3%，最大吸收波长为535nm.

陈士恩等［37］研究了牛肉中有机磷农药残留分析过程的最佳条件：36.8℃，pH＝7.7，反应时间3 min，显色剂2，6-二氯靛酚，最大吸收波长606nm.

曾孟祥等［38］研究了反应条件对酶促反应活性的影响，建立了酶抑制方程，确立了反应的最佳条件；发现多种金属离子对酶促反应具有激活作用，尤其是Cu2＋和Co2＋离子.

有关实验条件的研究各有侧重，主要的实验条件有：pH、温度、酶浓度、增敏剂、最大吸收波长、农药类型、显色剂类型和酶的存在形式等.由此可见植物酯酶活性在实际应用中受到的影响因素比较多，充分地研究各种因素对酶的活性的影响对植物酯酶抑制分析法的实际应用具有一定的指导意义.

5 问题与展望

目前植物酯酶应用于农药残留技术中主要存在以下问题：

植物酯酶酶种的选择问题.目前酶种的选择处于一种摸索的状态，虽然许多研究者也研究了多种植物的种子提取酶的工艺和活性对比，却没有酶种选择的相关理论的建立，无法有效地指导实际工作.

植物酯酶的固定化问题.大部分的研究工作都是围绕着酶抑制分光光度法来进行，所以在植物酯酶的应用中，固定化研究相对来说较少.而实际上，酶固定化之后酶的寿命和便利性都比酶液的要好.

植物酯酶的分析方法问题.采用植物酯酶抑制法进行研究的较多，其他方法较少，意味着植物酯酶在分析检测上的用途较为单一.此外，该法与其他分析方法结合的相关研究也较少.

植物酯酶在使用中的问题.酶液的使用寿命有限，实际使用过程中需现配现用；酶活性的干扰因素多，不易控制；不同农药对不同植物酯酶的抑制情况较为复杂；显色剂不稳定容易受到外界条件的干扰.虽然目前已经有固定化酶的出现，但是应用却不尽如人意，且固定化酶制作过程中酶的性能和结构都会发生改变.

大力发展固定化酶技术，将酶的固定化技术与其他新型快速的检测技术有机地结合起来将是今后一个重要的研究方向.

［1］户江涛.果蔬中农药残留检测前处理新技术研究进展［J］.现代化农业，2014（9）：30-31.

［2］张云霞.蔬菜中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留快速检测的影响因素研究［J］.现代农业科技，2014（17）：132-133.

［3］MOL H G J，VAN DAM R C J.Rapid detection of pesticides not amenable to multi-residue methods by flow injection-tandem mass spectrometry［J］.Anal Bioanal Chem，2014：406（27）：6817-6825.

［4］MOL H G J，VAN DAM R C J，STEIJGER O M.Determination of polar organophosphorus pesticides in vegetables and fruits using liquid chromatography with tandem mass spectrometry：selection of extraction solvent［J］.J Chromatography A，2003，1015（1）：119-127.

［5］CHERTA L，BELTRAN J，PITARCH E，et al.Comparison of simple and rapid extraction procedures for the determination of pesticide residues in fruit juices by fast gas chromatography-mass spectrometry［J］.Food Anal Methods，2013，6（6）：1671-1684.

［6］SCHULZE H，VORLOVA S，VILLATTE F，et al.Design of acetylcholinesterases for biosensor applications［J］.Biosens Bioelectron，2003，18（2）：201-209.

［7］ANDREESCU S，AVRAMESCU A，BALA C，et al.Detection of organophosphorus insecticides with immobilized acetylcholinesterase-comparative study of two enzyme sensors［J］.Anal Bioanal Chem，2002，374（1）：39-45.

［8］康天放，赵华，张雁，等.用植物酯酶法快速检测蔬菜中的有机磷农药［J］.北京工业大学学报，2006，32（12）：1057-1061

［9］雷明，张檀，文建雷，等.农药残留检测用植物酯酶的筛选［J］.西北植物学报，2008，28（1）：183-187.

［10］阮长青，杨娟，郭德军.不同植物酯酶对α-乙酸萘酯催化活性研究［J］.食品科学，2009，30（13）：183-186.

［11］王亚飞，张金艳.农药残留检测用植物酯酶源的筛选［J］.江苏农业科学，2011，39（4）：375-376.

［12］刘洋，赵红艳，刘如芬，等.农药残留检测用植物酯酶筛选研究［J］.安徽农学通报（上半月刊），2012，18（19）：177-179.

［13］李绍中，黄晓东，高新义，等.植物胆碱酯酶提取新工艺的研究［J］.食品科技，2007，32（4）：41-43.

［14］王振宇，王涛.小麦酯酶提取纯化工艺的研究［J］.中国食品学报，2009，9（3）：92-98.

［15］王亚飞，张金艳.苜蓿酯酶的提取分离及性质测定［J］.食品科技，2012，37（8）：173-175.

［16］周艳明，刘丹，胡睿，等.有机磷农残检测用植物酯酶的分离纯化及酶学性质的研究［J］.食品科技，2008，33（3）：53-56.

［17］温艳霞，兰文礼，李建科.大豆酯酶的分离、纯化及性质研究［J］.食品科学，2008，29（5）：292-294.

［18］徐礼鹏，吴正奇，万端极.超滤膜纯化麦芽根中5′-磷酸二酯酶的工艺研究［J］.食品科技，2013，38（5）：241-243.

［19］周艳明，刘丹，胡睿.冷冻干燥法制备植物酯酶［J］.食品工业科技，2007（12）：140-142.