浅析微生物鉴定在污染调查中的应用

鲍方名 沈海英

（苏州市食品药品检验所，苏州 215004）

浅析微生物鉴定在污染调查中的应用

鲍方名 沈海英

（苏州市食品药品检验所，苏州 215004）

通过对生化水平、基因水平和质谱微生物鉴定系统的分析介绍，比较了不同微生物鉴定系统的优缺点，讨论其在污染调查中的应用。针对生化水平和质谱微生物鉴定系统不能鉴定的微生物，不一定要选择基因水平鉴定，可以选择进行图谱溯源和消毒剂杀灭试验达到清除污染的效果。

微生物；鉴定；污染调查；

按照我国GMP要求，药品生产企业对生产环节的微生物污染需要定期监控。现有的药典和洁净室环境检测要求，通过微生物限度检查、无菌检查、沉降菌监测、浮游菌监测、接触碟和手套等多种手段收集污染微生物，得到量化的数据。而微生物鉴定通过鉴定不同来源的微生物种类，起到溯源调查、从源头控制污染和选择合适的消毒剂的作用[1]。

随着对鉴定效率的不断提高，自动化程度较高的商业化微生物鉴定系统逐步占据市场。法国梅里埃公司的Vitek 2 Compact在2005版药典中被提及。2014年10月，美国Biolog公司GEN III MicroStation型自动微生物鉴定系统在中国食品药品检定研究院化学药品检定所微生物检测室正式投入使用。2013年8月，FDA批准首个质谱仪系统VITEK MS用于鉴定细菌和真菌。微生物鉴定所需时间从小时正式进入分钟计算。但是，这些种类繁多的微生物鉴定系统真正能达到100 %鉴定吗？鉴定出的结果如何能更好的利用于污染调查？本文将介绍不同的微生物鉴定系统及其在污染调查中的应用。

1 生化水平鉴定

目前市场上用的比较多的生化反应鉴定系统有API，Phoenix-100，VITEK 2 Compact和Biolog。从基本原理上，API，Phoenix-100，VITEK 2 Compact系统就是生理生化方法的仪器化操作。通过固定在不同种类检测卡的数十种生化反应底物与待检菌进行反应，将待检菌的生理生化结果与数据库中的结果进行比对，得出相似度在一定数值的鉴定结果。优点是可同时进行多种生理生化测试，不需要人工配制多种生化反应底物；全程机器培养判读，避免经验不足影响人工判读；检测时间缩小到小时级别。而Biolog系统通过检测待测细菌对95种不同碳源的代谢情况，分析细菌的代谢过程，并通过对系统数据库的检索实现对待测纯系菌株的快速鉴定。

通过使用发现，由于还是生理生化反应的结果，不同培养时间的菌落检测结果不一致；不同系统的生化反应由于公司壁垒互有不同，鉴别结果有不一致的现象；各菌种数据库比较小，只有几百种左右，如表1所示，最多的Biolog系统也仅有2 700种；鉴定结果的相似度也有高有低，甚至不能鉴定。遇到相似度比较低或不能鉴定的情况，无法判断鉴定结果是否有效。要想起到溯源的效果，可以手动将卡位中的生理生化结果记录下来。

表1 不同鉴定系统菌种数据库比较Tab.1 Microbial database comparison of different identification systems

2 基因水平鉴定

16S rRNA基因序列在微生物中有着广泛的保守性和序列多态性，可以显示微生物的亲缘关系和进化特征，是现有条件下微生物分类学研究的重要手段。鉴定流程是菌落基因组提取，通过16S rRNA通用引物扩增得到16S rDNA，用T-克隆载体进行PCR产物克隆，送测序公司测序，测序结果与GenBank数据进行BLAST比对，得到相似度从高到低的鉴定结果。

由于最后的测序结果要用于比对，为了减少基因突变，必须选择保真度高的PCR聚合酶。New England Biolabs的科学家测定Taq聚合酶的错误率为2.7×10-4± 0.8×10-4，或每3 700个碱基1个错误。这些数据表明，利用Taq以25个PCR循环扩增400 bp的片段，可能一半的克隆都带有错误。对于较大的片段如1 kb左右的16S rRNA基因序列，每个克隆都可能带有不想要的突变。

鉴定流程中会涉及很多分子生物学物料，如果仔细研究说明书，会发现很多有“本产品仅供科研使用”或“This product is intended to be used for research only.They are not to be used for drug or diagnostic purpose.”的警示标志。 能否用于最后的判定还是仅作为参考还有待商榷。

BLAST比对的数据库GenBank为公用序列数据库，收录基因来源门槛极低，存在收录的基因质量不稳定，某些序列命名错误等种种问题。陈源源等从GenBank数据库中收集了细菌16S rDNA序列、丝状真菌ITS序列以及酵母26S rDNA D1/D2区域序列共88条，结果发现有17条序列（19.3 %）的长度过短，无法提供足够的系统发育信息；5条序列（5.6 %）存在错误命名或测序不准确问题；58条序列（65.9 %）没有相关文章发表；62条序列（70.4 %）无法获取对应的微生物保藏物[2]。从而提示了GenBank数据库的有限参考价值。Life公司等也根据自有的PCR体系及测序系统准备了商业化数据库 但是数量还是不能与GenBank相比，而且是搭配机器购买，收费昂贵。

3 MALDI-TOF质谱鉴定

MALDI-TOF质谱实现软电离，借助化学基质分析蛋白质。DHB（dihydroxybenzoic acid）最适合分析糖苷和糖蛋白，芥子酸最适合高分子量蛋白，CHCA（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid）最适合低分子量蛋白。激光造成样本和基质的挥发，形成的离子被高电压加速并在飞行管中以不同质量分开，在飞行管末端进行检测，得到全细胞的蛋白谱。

2013年8月21日美国食品和药品监督管理局（FDA）允许第一个质谱系统VITEK MS为自动鉴定已知在人类中致严重疾病的细菌和酵母菌。VITEK MS可鉴定193种不同的微生物和可在单一自动化测试系列中进行至192种不同的测试，每个测试花费约1 min。一般认为，不同菌种具有不同图谱。但是蛋白质谱是否能等同于基因图谱具有唯一性，还有待进一步研究。至于新型申请，FDA决议是基于一项7 068种微生物研究结果，相比排序和生化检测，VITEK MS可以将87.5 %的微生物鉴别到种属的水平。研究中VITEK MS为对3.2 %的微生物提供“无标识”结果。在所有的测试结果中，只有0.8 %的微生物鉴别是不正确的，也只有2.4 %鉴别结果与正确结果有低的区分力。孟冬娅等在比较并评价两种商业化MALDI-TOF MS系统中发现，VITEK MS会对表2中的3种菌鉴别出错误结果[3]。由于在严重疾病诊断过程中体现出极大的时间优势，MALDI-TOF质谱已经被各大医院配置使用。

表2 VITEK MS鉴定错误结果Tab.2 False identification result from VITEK MS

4 微生物鉴定在污染调查中的应用

通过以上各种鉴定方法的比较，不难发现不论是生化水平鉴定还是质谱鉴定，在现有的条件下都存在一定的不足，仪器厂家也在针对这些问题进行不懈的研究和进一步的开发。而基因水平的检测由于专业性较高，操作难度较大，还不能大范围地应用。而且基因检测的结果是否具有判断的效力还需要行业更进一步的规范。但是，如果我们在污染调查中遇到无法鉴定或者鉴定相似度不高的结果时，应该如何处理呢？其实，在污染调查中我们进行微生物鉴定，主要目的是想获得菌种的详细信息：便于发现在其他地方或者过去是否出现过，可以调查污染出现的源头。而且可以根据菌种的类型选择合适的消毒剂达到清除污染的效果。如果无法获得鉴定结果，以质谱系统为例，可以获得待检菌的质谱图用于溯源比对。同时，选择一些不同类型的消毒剂进行杀灭试验，获得有效的消毒剂种类和作用浓度，也可以达到杀灭的效果。

如图1所示，微生物污染调查可以按照流程图进行。同时，必须强调革兰氏染色和镜检在商业化检测之前的重要性[4]。正确的形态学结果是选择不同鉴定卡（生化鉴定）和不同基质（质谱鉴定）的基础，选择错误将直接导致鉴定无效（无法鉴定或鉴定错误）。在一些生化鉴定仪器的专家系统中，也常常要求进行补充生化试验来提供更进一步的判断依据。

图1 微生物污染调查流程图Fig.1 Microbial contamination investigation flowchart

5 结束语

随着药品行业和监管机构对微生物污染的不断重视，微生物鉴定的手段在不断推陈出新，鉴定的速度在飞速提高。但是，面对名目繁多的鉴定手段，一定不要忘记为什么鉴定的本来目的。从单一的药品生产企业来说，也没有必要建立那些比较大型的鉴定系统，如何利用好自己的鉴定手段建立自己的判断规则才是明智之选。如果遇到特别顽固的污染菌污染，可以选择专业的鉴定机构进行基因水平的鉴定。

[1] 范一灵，房蕊，蒋波，等.微生物鉴定分型技术应用于医药企业微生物污染调查[J].中国医药工业杂志，2010，41（11）：810-822.

[2] 陈源源，沈微，樊游，等.GenBank数据库中微生物rDNA序列准确性研究[J].食品与发酵工业，2012，38（3）：29-31.

[3] 孟冬娅，任微，罗艳萍，等.两种MALDI-TOF质谱仪对临床分离细菌鉴定结果的比较[J/CD].中华实验和临床感染病杂志：电子版，2014，8（2）：178-182.

[4] 陈东科.加强形态学检查提高细菌鉴定的准确性[J].实验与检验医学：2012，30（5）：419-422.

中国医药工程设计协会召开《医药工业洁净厂房设计规范》送审稿审查会

2015年7月22日，由中国医药工程设计协会组织，中石化上海工程有限公司主编的国家标准《医药工业洁净厂房设计规范》送审稿召开审查会。全国医药设计、生产、施工及监管部门的22位专家参加会议。

2009年6月1日正式实施的GB 50457—2008《医药工业洁净厂房设计规范》是我国医药工程领域第一本设计规范。随着我国《药品生产质量管理规范》（GMP）2010版的颁布实施，以及近年来国内外医药工程建设和医药洁净技术的不断发展，国家住建部将修订《医药工业洁净厂房设计规范》列入国家计划。编写组在总结我国医药工业洁净厂房设计经验的基础上，认真收集意见，开展调研测试，完成了规范修订版的征求意见稿。2015年2月，在公示并广泛收集社会意见的基础上，进一步修改完成了送审稿。

与会专家认真审阅了《医药工业洁净厂房设计规范》送审稿，一致认为：此次修编工作对规范我国医药工业洁净厂房设计水平起到了提升的作用，同时使医药工程设计有章可循，具有指导意义，代表了国内该领域设计规范的最新水平；本次修订工作思路清晰，其条文较好地反映了目前我国医药工业洁净厂房的特点，体现了与GMP宗旨的一致性。该规范在吸收国外医药工程设计经验的基础上，结合国情，注意与各相关标准协调一致，对医药工业洁净厂房设计中专业设计作了切合实际的规定，具有较好的实用性和可操作性。

中石化上海工程有限公司编写组成员表示将对该规范作进一步修改、完善，尽快完成报批稿。

（魏永忠）

第一、二届制药装备企业高管培训班圆满举办

为了让国内制药装备企业能更好地适应转型期的变化，提高企业的核心竞争力，中国制药装备行业协会开展了教育培训服务工作。近期的培训内容为了解《新经济时代的商业模式设计与创新》、《企业上市新机遇——新三板实务》方面，行业协会特邀请中国本土商业模式、营销策划专家黄宏教授和投融资与企业上市实践专家徐京教授授课、培训。

中国制药装备行业协会举办的第一、二届制药装备企业高管培训班，于2015年7月和8月分别在浙江瑞安和江苏常州开班。中国制药装备行业协会理事长高川等领导与来自全国各地制药机械企业的一百多位高管一起进行了为期两天的第一届学习培训。

第一届培训班开班仪式由赵琳副秘书长主持，理事长高川先生致辞。高理事长阐述本次高管培训班开班的意义时说：当前正值经济下行，制药装备行业发展的拐点期，企业如何创新，如何稳定长足地发展，企业如何利用资金市场的变革，进行资本运作走向新生，成了摆在各位企业家面前必然要思考的课题。抓住这个契机，为企业发展做些微薄服务，促进行业的发展，是协会存在的根本。本届培训班是首次尝试，将来还要把培训作为常态工作，在各个方面为企业提供服务。

（陈曦）

“大型偶联反应器工程技术开发及国产化研制”等3个项目通过技术鉴定

近期，中石化上海工程有限公司承担的中国石化科技开发项目——“大型丙烯腈装置污水回用处理成套技术开发”和“安全降耗密相输送工程技术开发”，以及与湖北化肥、江苏中圣共同承担的中国石化科技开发项目——“大型偶联反应器工程技术开发及国产化研制”3个项目通过中国石化集团公司组织的技术鉴定。3个项目共获得授权专利14项，具有自主知识产权，整体技术均达到国际先进水平。

（魏永忠）

Analysis of Use of Microbial Identification in Pollution Investigation

Bao Fangming, Shen Haiying
（Suzhou Institute of Food and Medicine Inspection Suzhou, 215004）

Through analysis of biochemical level, gene sequencing and mass spectrum identification system, the cons and pros of different microbial identification systems were compared, and their applications in contamination investigation were discussed.It is unnecessary to select gene sequencing method for the microbial which cannot be identified with biochemical level and mass spectrum identification system, but identification data and disinfection test may be used for cleaning contamination.

microbial identification; contamination investigation

TQ 460.38

：A

：2095-817X（2015）04-0060-003

2015-03-03

鲍方名（1982—），男，主管药师，主要从事药品微生物检测及净化工程检测。