狼毒多糖对TNF-α诱导的内皮细胞P-selectin表达的影响*

蒋丽艳 于智浦 宋波

转移是恶性肿瘤主要生物学特征之一，也是癌症患者死亡及远期疗效差的主要因素[1]，是一个多分子参与的极为复杂的过程[2]，细胞黏附为关键步骤之一，黏附过程涉及选择素（selectin）、整合素（integrin）、钙黏素（cadherin）等多种黏附分子[3]。P-选择素是细胞黏附分子家族的重要成员之一，在介导多种肿瘤细胞与内皮细胞间的黏附起了非常重要的作用[4-5]。因此，抑制P-selectin表达可能是治疗肿瘤转移的有效方法[6]。

狼毒多糖（EFP-AW1）是本实验室从狼毒大戟根部新发现并提取的低分子多糖化合物[7]，课题组前期研究证明其能够抑制人大细胞肺癌细胞NCI-H460与人脐静脉内皮细胞HUVECs的黏附，本试验以TNF-α诱导HUVECs 建立内皮细胞分泌P-selectin模型，研究狼毒多糖（EFP-AW1）对TNF-α诱导的内皮细胞P-selectin表达的影响，探讨EFP-AW1是否能够通过降低P-selectin的表达而抑制肿瘤细胞与内皮细胞的黏附。

1 材料与方法

1.1 实验材料 狼毒大戟购买于齐齐哈尔市药材公司，EFP-AW1为本实验室从中药狼毒大戟中新发现并分离提取的低分子多糖化合物[7]，分子量为10.830 Da；人脐静脉内皮细胞HUVECs购于美国ATCC细胞库；用于培养细胞的RPMI1640培养基和胎牛血清（FCS）均为HyClone产品；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）购于R&D公司。FITC标记的P-selectin鼠抗人单克隆抗体（BD公司）；Trizol（TaKaRa公司）；SYBR®ExScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa公司）；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 人脐静脉内皮细胞HUVECs培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，补充100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，置于5%CO2，37 ℃饱和湿度的CO2培养箱中培养，至细胞铺满瓶壁80%~90%传代，取5~6代的细胞用于实验，并将细胞分为五组，分别为空白对照组、TNF-α刺激组、EFP-AW1低剂量组、EFP-AW1中剂量组、EFP-AW1高剂量组。实验组细胞分别加入不同剂量EFP-AW1（5、10 μg/mL和20 μg/mL），作用48 h后，除空白对照组外均加入10 ng/mL TNF-α，37 ℃刺激2 h，收集细胞进行以下实验。

1.2.2 流式细胞术检测EFP-AW1对HUVECs细胞P-selectin蛋白表达的影响 收集1×106个HUVECs细胞，PBS洗2次，加入FITC标记的P-selectin鼠抗人单克隆抗体（CD62P）20 μL，4 ℃避光孵育30 min。PBS洗涤2次，加入PBS重悬细胞，FACS Calibur流式细胞仪检测。以上实验重复3次。

1.2.3 RT-PCR 检 测 TNF-α 诱 导 的 HUVECs细 胞P-selectin mRNA表达 利用Trizol试剂提取细胞总RNA。在20 μL RT反应体系中，取各组细胞总RNA 1 μg为模板逆转录合成cDNA，再以4 μL逆转录合成的单链cDNA为模板进行PCR循环。PCR反应引物序列如下：P-selectin 正向引物：5'-CAA TCA CTT TTA GCC AAA TATC-3'；反向引物5'-TTA TAA TTC AGC AAC CTG AAC TG-3'；β-action上游为：5'-AAG GAT TCC TAT GTG GGC -3'，下游为5'-CAT CTC TTG CTC GAA CTC-3'[8]。按说明书设置PCR扩增条件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；57 ℃，30 s；共 40 个循环。ABI7300荧光定量PCR仪进行PCR反应。采用相对定量法，根据下列公式按Ct值计算各基因的相对表达量：基因的相对表达量=2-△△Ct[注：△△Ct=（Ct目的基因-Ct对照基因）-（Ct内参目的基因-Ct内参对照基因）]

2 结果

2.1 EFP-AW1对活化HUVECs细胞表面P-selectin蛋白表达的影响 流式细胞术检测结果表明（图1），TNF-α刺激HUVECs后，HUVECs黏附分子P-selectin表达明显上升（P<0.05），而EFP-AW1低、中、高剂量组对TNF-α刺激的HUVECs P-selectin表达的上升均具有抑制作用（P<0.05）。

2.2 EFP-AW1对活化HUVECs细胞P-selectin mRNA表达的影响 根据 2-△△Ct值，计算各组 P-selectin 相对 mRNA 表达量，实验结果显示（图2）：TNF-α 刺激组HUVECs P-selectin 2-△△Ct值显著高于空白对照组（P<0.05），而EFP-AW1低、中、高剂量组2-△△Ct值与TNF-α 刺激组比较显著降低（P<0.05），表明EFP-AW1能够下调TNF-α诱导的HUVECs黏附分子P-selectin mRNA表达。

图1 EFP-AW1对活化HUVECs P-selectin蛋白表达的影响*与TNF-α组比较，P<0.05

图2 EFP-AW1对活化HUVECs P-selectin mRNA表达的影响*与TNF-α组比较，P<0.05

3 讨论

肿瘤细胞与内皮细胞间相互作用是造成肿瘤转移的重要环节[9-10]。在转移过程中，多种黏附分子发挥重要作用。黏附分子以配体（Ligand）-受体（Receptor）相对应的形式发挥作用，介导细胞与细胞间、细胞与基质间或细胞-基质-细胞之间的黏附，参与肿瘤转移等病理过程[11-12]。P-selectin是黏附分子家族的重要成员之一，Aigner等[13]报道肿瘤细胞能够通过其表面的P-selectin糖蛋白配体黏附到内皮细胞表面P-selectin上，从而介导内皮细胞与肿瘤细胞的黏附作用。已证实P-selectin能够和多种人类肿瘤细胞结合，如结肠癌、肺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、胃癌、舌鳞状细胞癌等[14]。因此，抑制内皮细胞P-selectin的表达是抗肿瘤转移治疗中的一个潜在靶点。

狼毒多糖（EFP-AW1）是本实验室从狼毒大戟根部新发现并提取的低分子多糖化合物[7]，课题组前期研究证明其能够抑制人大细胞肺癌细胞NCI-H460与人脐静脉内皮细胞HUVECs的黏附。静止的内皮细胞不表达或低表达P-selectin，当其受到组胺、凝血酶、TNF-α及LPS等激活后，可使已储存的P-selectin于数分钟内在细胞表面表达[15]。本试验以TNF-α诱导HUVECs建立内皮细胞分泌P-selectin模型，研究狼毒多糖（EFP-AW1）对TNF-α诱导的内皮细胞P-selectin表达的影响，探讨EFP-AW1是否能够通过降低P-selectin的表达而抑制肿瘤细胞与内皮细胞的黏附。研究结果表明，低、中、高剂量的EFP-AW1均可从核酸和蛋白水平抑制TNF-α诱导的内皮细胞表达P-selectin（P<0.05），并具有一定的剂量依赖性。表明EFP-AW1可能通过降低内皮细胞表面P-selectin的表达而抑制肿瘤细胞与内皮细胞的黏附，从而具有一定的抗肿瘤转移的潜在价值。

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