胎儿生长受限胎盘及正常足月胎儿胎盘中激活素受体的表达水平及其临床分析*

李雁 刘洪涛 李丽 陈春莹

胎儿生长受限又称之为宫内生长受限，胎儿出生体重明显低于正常胎儿，是导致围产儿死亡的主要原因，当前有关胎儿生长受限的研究有不少，一般认为与多种因素有关，胎盘在胎儿的发育中起到非常重要的作用，为分析胎盘中激活素受体对胎儿生长受限的影响，现分析胎儿生长受限激活素受体表达，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月-2014年8月本院妇产科分娩的产妇31例，依照患者分娩情况分为观察组16例和对照组15例，观察组胎儿生长受限，所有胎儿足月体重小于2500 g，Apgar评分大于8分，孕妇年龄（27.68±5.06）岁，BMI（18.37±5.09）kg/m2，产次（1.34±0.35）次；对照组患者分娩正常，足月胎儿出生体重大于2500 g，小于4000 g，Apgar评分大于8分，孕妇年龄（29.34±2.91）岁，BMI（21.63±3.61）kg/m2，产次（1.43±0.53）次。所有标本和资料均在获得患者同意后获取。两组患者孕妇均为初产妇，自然受孕，无生殖器官疾病，排除高血压患者、糖尿病患者、甲状腺疾病患者、新生儿先天性疾病患者以及遗传性疾病患者。

1.2 方法

1.2.1 胎盘组织HE染色 在患者胎儿分娩10 min后，剪去母体面胎盘组织，注意避免出血、钙化区，采用生理盐水冲洗干净后采用福尔马林液固定，并对两组患者进行标记编号。

胎盘组织染色采用苏木精-伊红染色法，将组织取材固定2 d后，采用流水反复清洗，进行透明处理、图蜡，放在EG-1160病例组织包埋机制成包块，采用切片机连续切片，放在50 ℃温水中贴片，并表上标签，脱蜡至水，放入苏木素染液中染色，将切块放在盐酸酒精溶液中，切块变为浅红色，在采用流水清洗，采用伊红染色，再次经过脱水处理，放在二甲苯溶液中浸泡3 min封存，观察胎盘切块发育情况等[1]。

1.2.2 胎盘组织免疫组化染色 在患者胎儿分娩10 min后，剪去母体面胎盘组织，采用生理盐水冲洗干净后采用福尔马林液固定，石蜡切块与上述一致[2]。将石蜡切片经过脱蜡止水，加过氧化氢溶液，消灭细胞内源性过氧化酶的活性，放入PBS中浸泡5 min，自然冷却，滴加一抗组织液，除去PBS液体，滴加A液50~100 μL，除去PBS液体，再滴加新鲜配制的DAB显色液50~100 μL，观察显色，满意后采用自来水清晰，采用苏木素染色，脱水封装[3]。

1.2.3 胎盘组织Real-Tine PCR检测 在患者胎儿分娩10 min后，剪去母体面胎盘组织，注意避免出血、钙化区，生理盐水冲洗干净后，放在-80 ℃水箱中保存[4]。将保存的标本取出，放在试管中，加入Trizol试剂1 mL，在冰浴中匀浆，转移到EP试管中，加入氯仿溶液2 mL，置于冰中5 min，离心15 min，取上层液体，加入0.5 mL异丙酮/Trizol液，混合均匀后，静置、离心，舍弃上清液，加入乙醇混合均匀后再离心，舍弃上清液，加入DEPC水50 μL。在紫外分光光度计上检测，OD260/OD280在1.8~2.0范围内为合格。调整RNA的浓度为0.5 μg/μL。实时定量荧光PCR测定中，先在95 ℃下预变性10 min，然后变性20 s，退火，结束后做溶解曲线。

1.3 评价标准 胎盘组织免疫组化染色结果在高倍显微镜下观察切块，细胞浆存在褐色颗粒为阳性，没有着色为0分，着色为浅黄色为1分，着色为棕色为2分，颜色深至深棕色为3分。没有观察到阳性细胞为0分，观察阳性细胞小于25%为1分，观察阳性细胞在25~50%为2分，观察阳性细胞大于50%为3分。实时定量荧光PCR测定中阙值定为0.8，相对表达量采用2-ΔCt[5]。

1.4 统计学处理 应用SPSS 22.0统计学软件分析数据，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，计数资料比较采用字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胎盘组织HE染色 对照组胎盘组织绒毛发育良好，主要是合体滋养细胞，观察组胎盘组织发育欠佳，存在较多绒毛内间质增生。

2.2 免疫组化染色 （1）对照组胎盘组织激活素受体ⅠA染色强度以（-）为主，无阳性染色，观察组激活素受体ⅠA表达定位与对照组保持一致。（2）对照组胎盘组织激活素受体主要表现细胞滋养组织胞浆和合体滋养为主，染色强度主要表现为（-），无阳性表达，观察组激活素受体ⅠB与对照组基本一致。（3）对照组激活素受体ⅡA表达以细胞滋养组织胞浆和合体滋养，观察组激活素受体ⅡA表达定位与对照组表达一致，染色强度主要是（++~+++）。（4）对照组胎盘组织激活素受体ⅡB主要表达细胞滋养组织胞浆和合体滋养，染色强度以（-）为主，观察组胎盘组织受体ⅡB表达定位与对照组基本一致，染色强度以（++~+++）为主。

2.3 激活素受体在两组胎盘组织中的表达 两组激活素受体ⅠA、ⅠB表达差异不明显（P>0.05），观察组ⅡA、ⅡB在（++），（+++）的百分比均高于对照组（P<0.05）；观察组ⅡA、ⅡB在（-）的百分比显著低于对照组（P<0.05），见表1。

2.4 胎盘组织中激活素受体基因的表达 观察组胎盘组织激活素受体ⅠA、ⅠB基因表达与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），观察组胎盘组织ⅡA、ⅡB表达明显高于对照组（P<0.05），见表2。

表1 激活素受体在两组胎盘组织中的表达 %

表2 胎盘组织激活素受体基因相对表达量（x-±s） %

3 讨论

胎儿生长受限是对围生期严重并发症之一，围产儿死亡率非常高，一般认为胎儿生长受限后导致血管、胰腺等重要组织器官的永久性改变。当前有关胎儿生长受限的研究有不少，一般认为与多种因素有关，研究胎盘生长受限胎盘激活素受体的表达有非常现实的意义[5-6]。

在本研究中分析胎儿受限胎盘与正常足月胎儿胎盘组织病理，通过HE染色观察发现，胎儿生长受限胎盘组织发育不佳，绒毛减少，钙化增多，结果提示实验组患者胎盘成熟与灌注不良有关。胎盘是母婴至今物质交换的重要器官，对胎儿的发育起到了重要作用，胎儿的冰壁变化与并发症的发生有很大关系。有研究指出胎盘主要是由绒毛间质、绒毛滋养细胞等构成，随着妊娠时间的不同，胎盘逐渐出现不同的变化，正常足月人本身，绒毛组织主要由合体滋养细胞构成。胎儿生长受限会导致胎盘合体滋养细胞出现变化，胎儿生长受限胎盘组织合体滋养细胞凋亡明显高于正常胎盘。在本研究中，结果与以往研究比较类似，推测胎儿生长受限的发生与胎盘发育不良有关[7]。

本实验通过免疫组化方法，分析激活素4种受体的表达和检测，结果表明胎盘组织激活素受体表达集中在细胞滋养细胞胞浆和合体滋养细胞中，也会在绒毛血管的内皮细胞中少量表达，这与近几年的研究比较类似。近几年很多研究表明妊娠晚期激活素受体主要来自于胎盘滋养细胞，四种激活素受体主要定位于胎盘绒毛血管的内皮细胞，本研究证实了这个观点。胎儿生长受限胎盘组织中激活素受体ⅡA、ⅡB表达说明明显高于对照组，细胞滋养细胞阳性染色最强[8]。有研究表明胎儿生长受限与滋养细胞的凋亡有关，在本试验中在胎盘组织中定位激活素水平，结果表明胎盘中细胞凋亡的定位在绒毛滋养细胞层中，与以往研究类似，推测激活素受体可能具有调节绒毛滋养细胞凋亡作用，导致胎儿生长受限的发生[9]。

在本研究中重点分析激活素与胎儿生长受限的关系。通过免疫组化实验方法和定量荧光PCR实验方法相结合，分别从基因水平和蛋白对激活素水平在胎盘组织中的表达进行检测，结果表明胎儿生长受限胎盘组织激活素受体ⅠA、ⅠB与对照组表达一致，胎儿生长受限胎盘组织激活素受体ⅡA、ⅡB表达明显高于正常足月胎盘（P<0.05），推测激活素受体ⅡA、ⅡB参与胎儿生长受限的发生[8]。采用不同的研究方法分析激活素受体的表达，结果一致，推测胎盘组织中ActRII表达水平升高会促使胎儿生长受限[10-12]。在以往的研究中指出激活素A参与到滋养细胞分化进而影响胎儿生长发育，在研究中可以看出胎儿生长受限胎盘组织中激活素受体ⅡA、ⅡB明显提高，推测与胎盘变化、血流密切相关[13-15]。

综上所述，通过实时定量荧光PCR方法和免疫组化方法，定位和检测激活素受体，胎儿生长受限患者胎盘激活素水平明显要高于正常胎盘，激活素紊乱会导致胎儿生长受限。在研究中分析胎儿受限胎盘与正常足月胎盘激活素受体表达，采用免疫组化实验方案和实时定量荧光PCR实验结合，很好的将蛋白表达与细胞定位相结合，这种实验方案具有更高的敏感性和特异性，能够进行定位定量检测，重复性好。胎儿生长受限的发病机制与多因素有关，在本研究中受到样本量的限制，仅仅分析妊娠晚期胎盘，还需要分析不同妊娠时期胎盘激活素的表达。有研究表明母体血清中激活素A水平能够预测胎儿生长受限疾病，在研究激活素受体表达中并未检测母体血清和脐血中激活素的表达，血清和脐血激活素与胎盘中的表达相关性没有准确的描述，在研究中排除了有合并症的胎儿生长受限病例，样本量很少，这方面还需要扩大样本，进一步的完善。

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