橘小实蝇对啤酒废酵母酶解液挥发性成分的触角电位反应

杜迎刚, 季清娥, 陈家骅, 赖钟雄

(1.潍坊科技学院生物工程研发中心，山东 寿光 262700；2.福建农林大学园艺学院；3.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002)



橘小实蝇对啤酒废酵母酶解液挥发性成分的触角电位反应

杜迎刚1,2, 季清娥3, 陈家骅3, 赖钟雄2

(1.潍坊科技学院生物工程研发中心，山东 寿光 262700；2.福建农林大学园艺学院；3.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002)

采用触角电位技术系统测试了橘小实蝇对啤酒废酵母酶解液挥发性成分的反应.结果表明：在啤酒废酵母酶解液挥发性成分中，3-甲基-1-丁醇、苯甲醛、苯乙腈、辛酸乙酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯是对橘小实蝇起引诱作用的主要物质，其对橘小实蝇激发的触角电位相对值均超过了参照正己醇.当v样品∶v石蜡=1∶100时，乙酸苯乙酯对雌性橘小实蝇激发的触角电位相对值和3-甲基-1-丁醇对雄性橘小实蝇激发的触角电位相对值与正己醇相比差异显著；苯甲醛对雄性橘小实蝇激发的触角电位相对值达1.7895，与正己醇相比差异极显著.当v样品∶v石蜡=1∶10时，对雌性橘小实蝇而言，苯甲醛、乙酸苯乙酯激发的触角电位相对值与正己醇差异显著，3-甲基-1-丁醇激发的触角电位相对值与正己醇差异极显著；对雄性橘小实蝇而言，苯甲醛、乙酸苯乙酯激发的触角电位相对值与正己醇差异显著，3-甲基-1-丁醇、乙酸辛酯激发的触角电位相对值与正己醇相比差异极显著.

触角电位; 啤酒废酵母; 酶解挥发物; 橘小实蝇

橘小实蝇[Bactroceradorsalis(Hendel)]为害46科250多种果树、花卉和蔬菜.近十多年来，其给我国福建、广东、广西、海南、湖南、云南、四川、贵州等省区的果蔬造成严重危害[1-2].基于实蝇综合治理经验的积累和对国外实蝇防治成功案例的分析[3-4]，人们对实蝇蛋白诱杀防治重要性的认识越来越清晰，逐渐开展了实蝇蛋白诱剂制备及其成分分析方面的研究[1，5].但有关蛋白诱剂中对实蝇起引诱活性的物质却鲜见报道.

触角电位(electroantennogram，EAG)技术是测定昆虫对次生挥发物生理反应的一种重要方法[6].蛋白诱剂对实蝇的吸引与蛋白材料水解或发酵过程中产生的挥发性成分有关[7].为明确具体的引诱活性成分，进一步了解此类蛋白的引诱机理，本研究将系统测定橘小实蝇对啤酒废酵母酶解液挥发性成分中已鉴定的15种物质[8-9]的触角电位反应，为实蝇引诱物质的开发和引诱蛋白的人工配制提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试虫源

橘小实蝇为福建农林大学益虫研究所2002年建立的室内种群，在其产卵盛期(羽化后10-14 d)采卵，人工饲料饲养，收集发育较一致的老熟幼虫让其在沙中化蛹，取上午7：00-9：00羽化的2-6日龄成虫作为本试验用虫.

养虫笼：28 cm×28 cm×28 cm塑料骨架加100目尼龙网.饲养条件：温度(25±1) ℃，相对湿度为75%±5%，光照L∶D=12∶12(光期7:00-19:00).

1.2 仪器和试剂

触角电位仪：荷兰Syntech公司，包括毛细管电极、Syntech MP 15微动操作仪、Syntech UN-06直流交流放大器和Syntech CS-05刺激气流控制装置.

试剂：3-甲基-1-丁醇(3-methyl-1-butanol)纯度99.6%，正己酸(hexanoic acid)纯度99%，壬酸乙酯(nonanoic acid-ethyl ester)纯度99%，甲氧基乙醇(ethyleneglycol-monomethyl ether)纯度99.8%，均为德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司产品；十二烷酸乙酯(ethyl laurate)、癸酸乙酯(ethyl caprate)、辛酸乙酯(ethyl caprylate)、苯乙腈(benzyl cyanide)均为标准品，美国AccuStandard公司产品；正辛酸(n-octanoic acid)纯度99%，乙酸辛酯(octyl acetate)纯度99%，苯乙醇(phenethyl alcohol)纯度99%，苯甲醛(benzaldehyde)纯度99.7%，乙醇(ethanol)纯度100%，均为北京百灵威科技有限公司产品；乙酸苯乙酯(2-phenylethyl acetate)纯度98%，为东京化成工业株式会社产品；丙酮(acetone)纯度99.8%，阿拉丁试剂(上海)有限公司产品；正己醇(hexyl alcohol)纯度97%，为美国Fluka公司产品；石蜡油纯度100%，为比利时Acros Organics公司产品.

1.3 触角电位测定方法

参照田厚军等[10]和Douglas et al[11]的方法，取用石蜡油配制的样品20 μL均匀滴于长约4 cm、宽0.5 cm的三角形滤纸片上，放入巴斯德管中，使管大口端连接刺激气流控制装置，送气管出气口与触角相距约1 cm并纵向垂直.调整连续载气流量为124 mL·min-1，刺激载体流量为20 mL·min-1，刺激时间为0.2 s，2次刺激之间隔50 s(以保证触角感觉器官功能完全复原).同一处理在同根触角上平行测试3次，每天每个处理各测试雌、雄橘小实蝇1根触角，连续测试5 d.测试顺序为对照、参照、样品(v样品∶v石蜡为1∶100、1∶10)、对照.每种化合物的EAG相对反应值根据下列公式计算.

EAG相对反应值=(待测样品的反应值-对照前后2次的平均反应值)/(参照的反应值-对照前后2次的平均反应值)×100%

1.4 数据分析方法

用Excel 2007和SPSS 19.0 for Windows统计分析软件处理数据，采用单因子方差分析对试验数据进行分析，用Duncan′s新复极差法分析EAG反应值的差异显著性.

2 结果与分析

2.1 不同时段的橘小实蝇对苯甲醛的EAG相对反应值

根据橘小实蝇对蛋白诱剂的反应存在时辰和日龄差异[12]，且实蝇气味结合蛋白对酮类物质具有强亲和性[13]等报道，本研究以啤酒废酵母酶解液挥发性成分中的醛类物质——苯甲醛为刺激物对橘小实蝇的EAG进行测定.从图1可以看出，在2种试验浓度下，雌、雄橘小实蝇对苯甲醛的EAG相对反应值均以12:00-13:00时段为底点，呈现有规律的双峰变化，且上午时段的峰值高于下午时段.对于雄性橘小实蝇，虽然2个试验浓度下均以8:00-9:00、9:00-10:00、10:00-11:00 3个时段的EAG相对反应值较高，但仅当苯甲醛浓度为1∶10时，8:00-9:00与12:00-13:00的EAG相对反应值存在显著差异(P<0.05).对于雌性橘小实蝇，当苯甲醛浓度为1∶100时，9:00-10:00、10:00-11:00、13:00-14:00 3个时段的EAG相对反应值与11:00-12:00、12:00-13:00时段存在显著差异(P<0.05)；当苯甲醛浓度为1∶10时，7:00-8:00、9:00-10:00、10:00-11:00 3个时段的EAG相对反应值显著高于11:00-12:00、12:00-13:00时段(P<0.05)，同时，9:00-10:00、10:00-11:00 2个时段的EAG相对反应值与14:00-15:00时段存在显著差异(P<0.05).综上所述，结合实蝇饲养的光周期及仪器的维护时间，确定系统测定橘小实蝇对啤酒废酵母酶解液挥发性成分触角电位反应的时间为8:00-11:00.

图中字母为Duncan′s多重比较结果，不同字母表示同一浓度同一性别在不同时段间的差异达到0.05显著水平.

2.2 橘小实蝇对啤酒废酵母酶解液挥发性物质的EAG相对反应值

从表1可以看出，啤酒废酵母酶解液挥发性成分中的很多物质都能激发橘小实蝇很强的EAG反应.其中，3-甲基-1-丁醇、苯甲醛、苯乙醇、苯乙腈、辛酸乙酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯激发的EAG相对反应值均超过了参照正己醇.对雌性橘小实蝇而言，当测试样品浓度为1∶100时，乙酸苯乙酯激发的EAG相对反应值高达1.4609，与参照相比差异显著(P<0.05)；乙醇、甲氧基乙醇、壬酸乙酯、癸酸乙酯、十二烷酸乙酯激发的EAG相对反应值显著低于参照(P<0.05).当测试样品浓度为1∶10时，苯甲醛、乙酸苯乙酯激发的EAG相对反应值与参照间存在显著差异(P<0.05)，而3-甲基-1-丁醇激发的EAG相对反应值高达2.6756，与参照相比差异极显著(P<0.01).对于雄性橘小实蝇，当测试样品浓度为1∶100时，3-甲基-1-丁醇激发的EAG相对反应值与参照间存在显著差异(P<0.05)，苯甲醛激发的EAG相对反应值高达1.7895，与参照相比差异极显著(P<0.01)，而乙醇激发的EAG相对反应值仅与对照石蜡相当；当测试样品浓度为1∶10时，正己醇激发的EAG相对反应值与苯甲醛、乙酸苯乙酯差异显著(P<0.05)，与3-甲基-1-丁醇、乙酸辛酯差异极显著(P<0.01).此外，不同性别的橘小实蝇对同一物质同一剂量的反应也表现出一定差异，雌性橘小实蝇对丙酮的EAG相对反应值高于雄性，且这种差异在低浓度时更大，该情况在高浓度的癸酸乙酯、辛酸乙酯上同样存在，但对高浓度乙酸辛酯的EAG相对反应值却低于雄性.

3 小结与讨论

啤酒废酵母酶解液挥发性成分中的3-甲基-1-丁醇、苯甲醛、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯浓度为1∶100时对橘小实蝇激发的EAG相对反应值就已超过参照正己醇1∶10浓度时的EAG相对反应值，而苯甲醛对雄性橘小实蝇激发的EAG相对反应值在此浓度下高达1.7895；苯乙腈激发的EAG相对反应值也远超过了同浓度的正己醇，其在收集的啤酒废酵母挥发性成分中的相对含量达40%以上[8]；辛酸乙酯在1∶10浓度时能引发橘小实蝇特别是雌性很强的触角电位反应，其在收集的啤酒废酵母挥发性成分中的相对含量达13%以上[8].这些可能是啤酒废酵母酶解蛋白对本地橘小实蝇表现较强引诱活性[1]的物质基础.在试验过程中还发现，辛酸和己酸对实蝇激发的触角电位反应比对照石蜡弱或呈现相反的触角电位反应，说明这2种酸对橘小实蝇有驱避活性[14].这与室内这2种物质单独或与3-甲基-1-丁醇复配的引诱试验结果一致.此外，苯甲醛、乙酸辛酯、3-甲基-1-丁醇对雄蝇激发的EAG相对反应值高于雌蝇，这可能是杜迎刚等[2]发现橘小实蝇雄性较雌性先发现蛋白源的原因.

表1 橘小实蝇对不同浓度啤酒废酵母酶解液挥发性物质的EAG相对反应值1)

1)表中字母为Duncan′s多重比较结果，同列数据后附不同大、小写字母者分别表示同一性别对不同物质反应的差异达0.01、0.05显著水平.

六碳直链醇类、醛类和乙酸酯类是植物叶片内的亚油酸、亚麻酸氧化分解的产物，称为“绿叶气体”[15].因此，啤酒废酵母蛋白诱剂中的乙酸苯乙酯、乙酸辛酯都属于“绿叶气体”，其低浓度能够激发橘小实蝇很强的触角电位反应；橘小实蝇对3-甲基-1-丁醇具有较强的触角电位反应，而其存在于橘小实蝇嗜好的多种寄主如香蕉、丝瓜、苦瓜[16]中；苯甲醛能够引发橘小实蝇很强的触角电位反应，其也存在于橘小实蝇多种嗜好寄主如柑橘、苦瓜[16]中.这些都说明啤酒废酵母蛋白诱剂对橘小实蝇的引诱机理与寄主植物对其引诱机理类似.

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(责任编辑:杨郁霞)

Electroantennograhic responses of oriental fruit fly,Bactroceradorsalis(Hendel),to volatile enzymatic hydrolysate from spent brewer′s yeast

DU Ying-gang1,2, JI Qing-e3, CHEN Jia-hua3, LAI Zhong-xiong2

(1.Biological Engineering Research and Development Center, Weifang University of Science and Technology,Shouguang, Shandong 262700, China; 2.College of Horticulture; 3.College of Plant Protection,Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Electroantennogram (EAG) was employed to record the electrophysiological responses ofBactroceradorsalis(Hendel) to the volatile enzymatic hydrolysate from spent brewer′s yeast. The results showed that 3-methyl-1-butanol, benzaldehyde, benzyl cyanide, ethyl caprylate, octyl acetate, phenethyl acetate could evoke higher relative EAG values than hexanol, the reference. When the concentration of the sample and paraffin was 1∶100 (v∶v), the relative EAG values of phenylethyl acetate to females and 3-methyl-1-butyl to males showed significant differences compared with hexanol. The relative EAG value of benzaldehyde to male was 1.7895 and showed extremely significant difference compared with hexanol. When the concentration was 1∶10 (v∶v), for females, the relative EAG values of benzaldehyde and phenylethyl acetate showed significant differences, and that of 3-methyl-1-butyl showed extremely significant difference compared with hexanol. For males, the relative EAG values of benzaldehyde, phenyl ethyl acetate showed significant differences, and that of 3-methyl-1-butyl and octyl acetate showed extremely significant differences compared with hexanol.

electroantennogram (EAG); spent brewer′s yeast; volatile enzymatic hydrolysate;Bactroceradorsalis

2014-11-25

2015-02-27

山东省自然科学基金项目(ZR2011CQ002);潍坊市科学技术发展计划项目(2014GX043);国家星火计划项目(2014GA740109).

杜迎刚(1977-),男,副教授.研究方向：农业昆虫与害虫防治.通迅作者赖钟雄(1966-),男,研究员，博士生导师.研究方向：园艺植物生物技术.Email：22246344@qq.com.

S475.1

A

1671-5470(2015)04-0355-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.04.004