水中白骨化尸体的DNA检验

张自雄，胡丽梅，向峰，邹军根

（巴中市公安局物证鉴定所，四川巴中 636000）

·经验交流·

水中白骨化尸体的DNA检验

张自雄，胡丽梅，向峰，邹军根

（巴中市公安局物证鉴定所，四川巴中 636000）

法医遗传学；磁珠法；硅膜法；股骨；牙齿

白骨化尸体的身源鉴定往往是法医学鉴定的难点之一。通常选用长骨、牙齿作为检材，然而对于水中浸泡的白骨化尸体则增加了DNA检验的难度，如何建立稳定、有效的检验方法具有重要意义。本研究就本实验室近年来对在水中浸泡后形成的50例白骨化尸体的DNA检验，总结经验，介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

各类案件发现的水中白骨化尸体50例，共取得股骨50根、牙齿50枚。

1.2 方法

1.2.1 预处理

取股骨干一段，沙纸反复擦拭去除表面污垢，5%次氯酸钠溶液清洗表面，蒸馏水清洗3～6次，无水乙醇冲洗一次，晾干，最后紫外光照射。

取送检牙齿，用蒸馏水浸泡清洗表面，并用棉签、刀片等除去牙齿表层污垢，加入5%次氯酸钠浸泡10min左右，弃废液，蒸馏水泡洗3～5次，95%乙醇溶液浸泡1 h，用滤纸吸干，以紫外线消毒牙齿各面各15min。

1.2.2 裂解

将牙齿用简易砸牙器砸成牙齿粉末，用电钻钻取股骨干部位制成骨粉，分别置于1.5mL离心管中，加入0.5mol/L脱钙液（EDTA），振荡后放于37℃水浴箱脱钙24h，隔12h离心，更换EDTA。脱钙完成后，以离心半径5cm，13000r/min，离心5min，弃去上清液，牙齿粉末中加入300 μL骨骼裂解液、30 μL DTT溶液（1 mol/L）以及30 μL PK溶液（20 mg/μL），56℃消化12 h，消化完全后，以离心半径5 cm，13 000 r/min，离心5min，将上清液移至新1.5mL离心管中进行纯化。

1.2.3 纯化

取以上上清液各一半分别采用硅膜法（QIAquick纯化试剂盒，德国QIAGEN公司）和磁珠法（DNA IQ试剂盒，美国Promega公司）试剂进行DNA纯化。

硅膜法纯化步骤：（1）将上清液与体积相同的V氯仿/V异戊醇=24∶1混匀，以离心半径5cm，13000r/min，离心5min，吸取上层水相至5mL试管中。（2）用纯化试剂盒中的PBI试剂与上清液按5∶1体积振荡混匀，然后向纯化柱中加入适量混合液，以离心半径5cm，13000r/min，离心1min，重复操作直到混合液全部过滤。（3）加300μL PBI试剂离心并洗涤1次，加入已配制的洗涤液（PE），离心并洗涤3次，再以离心半径5 cm，13 000 r/min，离心1 min，将纯化柱放到新的1.5mL微量离心管上，打开盖子于室温中挥发5min。（4）将洗脱液（EB）20 μL加入纯化柱的硅膜中心，65℃恒温5 min，以离心半径5 cm，13 000 r/min，离心1 min，收集微量离心管内液体用于PCR反应或置于4℃，保存备用。

磁珠法纯化步骤：（1）取适量液体样品放入1.5mL离心管中，加入2倍体积配制好的裂解液（内含1μL 1mol/L DTT）和7μL磁珠，旋涡振荡使磁珠悬浮，室温放置5min。（2）旋涡振荡后将离心管放在磁架上，小心吸去液体。（3）用100μL裂解液洗涤一次，旋涡振荡使磁珠悬浮，将离心管放在磁架上，小心吸去液体。（4）用100μL洗液洗涤3次，每次旋涡振荡使磁珠充分悬浮。（5）打开离心管盖，室温下空气干燥5～10min。（6）加入30μL的EB洗脱液，盖好盖子，65℃加热5min。（7）从水浴中取出离心管，立即用旋涡振荡器振荡离心管，待磁珠悬浮后，立即将离心管放回磁架上。（8）小心将DNA溶液吸到干净离心管中用于PCR扩增或置于4℃冰箱保存。

1.2.4 PCR扩增和电泳检测

采用Identifiler试剂盒（美国AB公司）扩增，操作按照仪器及试剂使用说明书进行。

扩增后用3130XL遗传分析仪（美国AB公司）进行电泳检测，GeneMapper v3.2软件分析结果。

2 结果与讨论

在50例送检检材中，对股骨采用硅膜法纯化获得STR分型46例，采用磁珠法纯化获得STR分型42例。牙齿采用硅膜法纯化获得STR分型50例，采用磁珠法纯化获得STR分型47例。经与失踪人员亲属DNA STR分型比对，均符合生物学遗传关系。

通过对水中白骨化尸体长骨、牙齿的DNA检验，笔者认为牙齿DNA检验效果优于长骨。虽然牙齿和长骨内的DNA分子保存均较长，但是牙齿有3种坚硬的矿化组织保护，因此对于时间和外界环境（如水）有较强抵抗力，而长骨正是缺少这样一种特殊的保护，其DNA分子往往受到破坏而降解。因此条件允许的情况下，对于白骨化尸体，DNA检验时选择牙齿检材要优于长骨。同时选择的牙齿要保证其完整性，优先选择磨牙。在选择纯化试剂盒的方面，本实验室在纯化过程中分别采用了磁珠纯化法和硅膜纯化法进行结果比较，发现硅膜法纯化法优于磁珠纯化法，分析其原因可能为硅膜可通过控制孔径选择性地滤过DNA分子，达到最佳纯化目的。

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.017

1004-5619（2015）02-0147-01

2014-09-24）

（本文编辑：李成涛）

张自雄（1979—），男，四川巴中人，主检法医师，主

要从事法医物证学检验工作；E-mail：37788913＠qq.com