2015年版《中国药典》微生物限度检查法洁净环境及计数培养基修订分析探讨

景荣先 张国林

1.苏州市立医院本部药学部,江苏苏州 215002；2.苏州市食品药品检验所,江苏苏州 215104

微生物限度检查是用于检查非无菌制剂及其原料、辅料等是否符合规定的方法[1-2]。为防止污染,确保检查结果的准确性,微生物限度检查必须在受控的洁净环境中进行,并严格执行检验过程的无菌操作。培养基是进行微生物限度及无菌检查的主要载体,其质量合格与否及选择的合理性直接关系到检查结果的准确性和可靠性。2015年版中国药典对微生物限度检查的洁净环境、培养基及检查方法进行了修订。该文比较分析2015年版中国药典与2010年版中国药典在非无菌产品微生物限度检查时洁净受控环境与计数培养基异同点,为更规范执行新版中国药典提供参考。

1 2015年版与2010年版中国药典微生物检查项目异同

微生物限度检查法主要用于检查非规定灭菌的制剂及其原料、辅料等是否符合规定的标准方法。2010年版中国药典微生物限度检查法中检查的项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌(大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌及白色念珠菌)[1]；而2015年版中国药典对计数法微生物检查项目界定为嗜温细菌和真菌,同时将控制菌检查中的“大肠菌群”修订为“耐胆盐格兰阴性菌”[2],见表1。

表1 2015年版与2010年版中国药典微生物检查项目异同

2010年版中国药典中规定微生物限度检查的计数项目中细菌培养温度为30～35℃,霉菌和酵母菌培养温度为23～28℃,因此,样品中可能存在的极端微生物在此条件下无法检出。因此,2015年版中国药典对计数法检查项目界定为嗜温细菌和真菌具有合理性。大肠菌群是能发酵乳糖产酸、产气的一类需气或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,主要来源于粪便,是判定食品、药品等是否被粪便污染的重要指标；而耐胆盐革兰氏阴性菌是一类在胆汁酸中可以存活并繁殖的革兰氏阴性菌,其范围比大肠菌群更广,包括肠杆菌科、产单孢菌属及家单孢菌属等,且该方法在大肠菌群检测上更容易操作和进行结果判读[3]。同时,现行的美国药典也是采用检查耐胆盐革兰氏阴性菌进行报告。

2 2015年版《中国药典》微生物限度检查法环境修订与分析

微生物限度检查时洁净环境是保证检查结果准确性的重要保证。2010年版中国药典中规定“微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行”,而2015年版中国药典要求“微生物计数试验应在受控环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行”。新旧版药典的变化首先是洁净环境洁净度称谓上的变化：2015年版中国药典与2010年药品生产质量管理规范的称谓一致,将环境洁净度的等级按照A、B、C、D级进行划分。2010年版中国药典的洁净度等级划分样式目前多应用于无菌医疗器具生产及保健品、化妆品生产厂房等洁净度的划分。虽然D级与10 000级环境在洁净环境的关键项目尘埃数和沉降菌控制方面无明显差别：D和10 000级洁净环境控制≤5μm和≤0.5μm粒子数为≤29 000/3 520 000个/m3和≤20 000/3 500 000个/m3(静态),而二者对沉降菌的控制相同,均为≤10个/平皿(静态)。

为防止检验过程造成污染影响检验结果,目前微生物限度检查时的洁净环境一般要求不低于其生产时的洁净环境度,而目前非无菌制剂生产环境主要处于C级或D级洁净环境下。同时,考虑到洁净环境的洁净度越高,相应的运行成本越高、风险越大[4-5],因此,将微生物限度检查的洁净环境定位于“受控环境(C级或D级)下的局部洁净度不低于B级(A级或B级)的单向流空气区域内进行”是合理的。见表2。

表2 2015年版《中国药典》微生物限度检查法环境修订与分析

3 2015年版《中国药典》微生物限度检查法技术培养基比较

2010年版中国药典微生物限度检查法中计数检查的项目包括细菌数、霉菌和酵母菌数；而2015年版中国药典对计数法检查项目界定为嗜温细菌和真菌。2010年版细菌和霉菌及酵母菌计数采用的是营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基,而2015年版中国药典检查嗜温细菌和真菌采用的是胰酪胨大豆琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基。有研究表明胰酪胨大豆琼脂培养基上细菌的生长状态更佳,该培养基更适合于细菌的计数检查[6]。另外,新版中国药典增加了含抗生素的玫瑰红钠和沙氏葡萄糖琼脂选择性培养基用于因沙氏葡萄糖琼脂上因细菌生长而造成的霉菌和酵母菌计数不合格的情况,克服了2010年版中国药典的不足。另外,2015年版中国药典取消了酵母浸出粉胨琼脂培养基用于酵母菌计数的方法。2015年版中国药典的以上修订均与现行的美国药典要求趋向于一致。见表3。

表3 2015年版《中国药典》微生物限度检查法技术培养基比较

4 讨论

与2010年版中国药典相比,2015年版中国药典对微生物限度检查及无菌检查方法进行了较大的修订,包括培养基的选择、验证方法、检查是的洁净环境等多个方面。该文主要分析了新版药典中微生物限度检查在计数培养基和洁净环境方面的变化。总体上来看,新版药典微生物限度检查与无菌检查修订后在培养基选择、方法验证、洁净环境的控制方面均向现行的美国药典靠拢。两国药典标准的一致性为药品生产企业通过GMP认证及出口贸易均具有积极的意义。本文中参考的内容来自于《中国药典》2015年版总则(草案)第二次公开征求意见稿,其内容可能与正式稿有所出入。如正式稿内容有所变化,一切以正式稿为准。

[1] 国家药典委员会.中国药典2010年版[M].北京：化学工业出版社.

[2] 曾婧娉,崔蓉,李全兴,等.苯酚滴耳液微生物限度检查方法的建立与验证[J]. 中国现代应用药学,2015,32(1):78-81.

[3] 国家药典委员会.关于《中国药典》2015年版总则(草案)第二次公开征求意见的通知[EB/OL].(2014-07-28)http://www.chp.org.cn/cms/newscenter/news/000623.html.

[4] 朱文娟.大肠菌群检查与胆汁耐受革兰阴性菌检查比较研究[J]. 中国医药指南,2012,10(34):109-111.

[5] 李立,张利群. 洁净室净化空调系统的节能浅探[J]. 洁净与空调技术,2014(3):46-47.

[6] 陈伟盛,朱荣峰,关倩明.统计分析在洁净室污染评估及风险分析中的应用研究[J]. 中国医药工业杂志,2014(10):1004-1008.

[7] 由亚宁,陈雪芹,周志云,等.2005年版《中国药典》和《欧洲药典》菌落计数培养基比较[J]. 中国药事,2010,24(6):587-589.