分子成像技术在小分子酪氨酸激酶抑制剂开发中的应用

程雁，孙夕林，申宝忠

分子影像技术是指运用影像学方法研究活体状态下组织、细胞和亚细胞等的特定分子水平变化。其中，分子或细胞水平反映的是生物体生理、病理变化，它为在体监测疾病过程、在体示踪基因治疗、在体评价药物疗效及在体揭示分子活动规律提供了崭新的技术方向。并将遗传基因信息、生物化学与新的成像探针进行综合，利用精密的成像技术来检测，通过一系列的图像后处理技术，真正达到在体、实时、动态、无创、特异等优点[1，2]。以往的小分子酪氨酸激酶抑制剂的临床前治疗药物疗效评价都是在离体细胞水平以及动物实验基础上开展的。动物实验研究通过观察移植瘤经药物治疗前后的体积，并根据治疗前后体积缩小的程度来评价不同药物治疗的效果，从而筛选出临床候选药物及药物的最佳使用剂量。现如今，利用分子成像新技术可获取许多新的在体数据，如肿瘤生长动力学评估；肿瘤功能及分子成像；促血管生长因子；肿瘤细胞标记物等活体分子成像，并可在无创的条件下研究肺癌发病机制。此外分子影像技术还有可能通过对活体实时分子靶目标评估来筛选治疗药物[1，3]。如果将分子成像与微创治疗相结合，使我们有可能在发现疾病的同时实现在体直接治疗。

分子影像技术与传统影像技术

分子影像技术主要利用核医学（positron emission tomography，PET）、磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）和光学（optical coherence tomography，OCT）等医学影像技术，在分子水平上对人体内部生理或病理过程进行无创、实时成像。传统的医学影像技术以人体内部的物理性质或生理特性作为成像对比源，这些物理量和生理量没有特异性。经典的影像诊断（X线、CT、MRI、超声等）主要显示的是一些分子的改变，即器官发生了器质性变化之后才能检查到，仅能用于具有解剖学改变的疾病检测。而分子影像技术不仅能够探查疾病过程中细胞和分子水平的异常，还能在疾病尚无解剖改变前检出异常，为探索疾病的发生、发展和转归，评价药物的疗效以及在生物学和临床医学发展之间起到桥梁作用[1，4，5]。

酪氨酸激酶及其小分子抑制剂

近年来，肿瘤病理学、细胞生物学、肿瘤基因学等研究取得了巨大的进展，其中恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞外基质的相互作用等各种过程正在被逐步阐明。将这些信号转导通路的关键酶作为药物筛选靶点，发现选择性作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗肿瘤药物已成为当今抗肿瘤药物研究发展的重要方向。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，它能催化ATP分子上γ-磷酸基转移到许多重要底物蛋白质的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。这一过程是酪氨酸激酶抑制剂研发的重要切入点，研究者们也是依据ATP竞争性抑制的原理建立了众多酪氨酸激酶抑制剂分子水平的影像筛选方法[3，6，7]。已有资料表明，超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，他们的异常表达将导致细胞增殖调节发生紊乱，进而导致肿瘤发生[6，8]。事实上，以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的开发已成为国际研究的前沿[8，9]。

分子成像技术在小分子酪氨酸激酶抑制剂开发中的应用

分子影像技术可对基于小分子靶向性的酪氨酸激酶抑制剂进行筛选，临床候选药物的药代动力学和药效学特性分析，药物分子所作用的靶点以及生物过程的体内效果可视化有所帮助[10]。这种方法可用于筛选小分子酪氨酸激酶抑制剂临床候选药物和测定药物代谢时间及最佳使用剂量。因此，分子影像技术具有加快临床前期和临床期作用于肿瘤的酪氨酸激酶抑制剂类药物开发的潜力[11，12]。

1.同位素法

同位素法是一类较早应用于酪氨酸激酶抑制剂筛选的经典方法。恶性肿瘤细胞的主要代谢特点是高葡萄糖代谢，因此我们可以用18F-脱氧葡萄糖（18F-2-fluoro-D-deoxy-glucose，18FFDG）作为筛选肿瘤治疗药物的代谢示踪剂。NAII等[12]用PET／CT对经吉非替尼治疗的非小细胞肺癌患者进行成像获取18F-FDG-葡萄糖的摄取情况，观察吉非替尼对肺癌患者的治疗疗效，并根据患者的原发肿瘤的最大标准摄取值（SUV）的大小，利用患者的反应率和存活率间接评价药物的活性。也有研究报道对首次经甲磺酸伊马替尼治疗胃肠道间质肿瘤病人使用18F-FDG-PET检测24h内药物疗效改变，研究结果表明经小分子酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼治疗后也表现出较好的治疗效果[13，14]。最近有研究证实非小细胞肺癌小鼠模型给予吉非替尼治疗的48h内，18F-FDG的摄取敏感型降低，并于48h后评价肿瘤对吉非替尼的反应，这有益于我们筛选出吉非替尼治疗敏感的患者以及吉非替尼使用的局限性[15，16]。此外，FDGPET影像技术在评价药物药效中的作用要远远优于以往通过收集患者存活时间数据来评价药物疗效[17]。

还有一部分示踪剂技术是用来探测小分子酪氨酸激酶抑制剂对机体肿瘤的乏氧显像。18F标记的氟化硝基咪唑阿拉伯糖苷（18F-fluoroazomycin-arabinoside，FAZA）是 肿 瘤 乏 氧 显 像的常见示踪剂，该示踪剂在缺氧环境中可形成活跃的自由基并与细胞大分子共价结合。结合FAZA的PET成像技术显示：EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼（易瑞沙，阿斯利康公司）降低了大鼠鳞状细胞癌转移中的组织缺氧[18]，间接地证实了吉非替尼对肿瘤的治疗疗效。肿瘤的乏氧显像在酪氨酸激酶抑制药物开发中具有重要的价值。

近年来，随着分子靶向治疗的深入，以TK为前体标记核素的肿瘤表皮生长因子受体（EGFR）分子影像酶显像也逐渐受到关注。因为酶不仅能催化体内生物化学过程还具有极高效率、高度特异性及反应的可调节性等优点。Johnstrom等[19，20]合成11C-4-（3-溴苯氨基）-6，7-双甲基喹唑啉（PD153035），并应用PET显像评价其在裸鼠体内的分布，随着EGFR表达水平的升高摄取量增加。研究结果显示11C-PD153035的放射性摄取与EGFR表达水平显著相关，T／NT比值在40～50min内达高峰，不同的肿瘤峰值不同，T／NT比值与EGFR的表达水平成明显正相关。间接说明肿瘤组织对小分子酪氨酸激酶抑制剂PD153035有较高的敏感性。

2.胆碱酯酶标记法

胆碱标记物通常反应肿瘤细胞的增殖情况，14C-甲基标记的胆碱可用于针对酪氨酸激酶受体（TKR-Ras-Rafl-MEKERK）级联反应，这为分子成像技术在信号转导通路中可视化应用提供了可能，也为检测小分子酪氨酸激酶抑制剂在体内的作用提供了可能性[21]。目前胸腺嘧啶核苷（18F-FLT）在检测核酸的合成和代谢情况中的特异性高于临床常用的肿瘤PET药物18F-FDG，为酪氨酸激酶抑制剂抑制肿瘤细胞增殖的检测及监控此类药物代谢情况提供了有效的方法[22，23]。

Hsin等[24]发现与之前报道的小分子酪氨酸激酶显像剂[124I]-IPQA相比，[18F]F-PEG6-IPQA具有更好的药代动力学特点。这一特点说明PEG6具有提高EGFR高表达的放射性标记化合物示踪技术在肿瘤分子成像应用中的潜能。[18F]FPEG6-IPQA的PET／CT成像技术可被用来检测表达EGFR L858R突变的肿瘤以及与[18F]F-PEG6-IPQA药代动力学相似的小分子酪氨酸激酶抑制剂治疗优势人群的筛选。本研究还可以通过对比治疗前后[18F]F-PEG6-IPQA的摄取情况评价小分子酪氨酸激酶抑制剂的疗效。

3.多模态分子成像

多模态分子影像技术在肿瘤早期诊断中的应用主要以荧光分子探针为基础，合成多功能靶向探针，结合光学成像与MRI来实现肿瘤及癌前病变的早期诊断[25，26]。宋歌[27]构建了QDs＠Gd3±RGD[一类含有精氨酸.甘氨酸-天冬氨酸（Arg.Gly.Asp）的短肽]双模态显像纳米探针成功实现体外大肠癌Lovo细胞的MRI显像及治疗作用。张琨[28]采用化学交联法构建VEGF抗体MR靶向超顺磁性分子探针，研究表明携带纳米铁颗粒的抗VEGF分子探针已将肿瘤血管生成的评价发展到受体水平，为肿瘤血管生成的诊断与抗血管生成的治疗提供了新的思路。Blankenberg[29]等用99mTc标记血管内皮生长因子（vascular endothrlia growth factor，VEGF）的 一 条 单 链（scVEGF／99mTc）可用来评估VEGF受体（VEGFR）对肿瘤治疗药物帕唑替尼抗血管生成疗效。

多模态分子成像研究是对肿瘤关键分子靶点表皮生长因子受体（EGFR），采用光学、PET等不同成像方法，进行多模态分子成像，实现不同影像设备的优势互补，获得多元化信息，使监测结果更为精确[30，31]。肿瘤微环境分子成像研究。在肺癌肿瘤微环境方面，项目组利用18F-FDG（糖代谢成 像）、18F-FLT（增殖成像）和18F-FMISO（乏氧成像）三种分子成像探针，检测其在肺癌肿瘤细胞内的摄取机制和分布，探讨肺癌组织内18FFDG、18F-FLT和18F-FMISO三种分子探针摄取和肿瘤乏氧、增殖和血流灌注微环境的关系[32]。

4.评价小分子酪氨酸激酶抑制剂动力学模式

经分子影像技术筛选得到的有活性的酪氨酸激酶抑制剂，它与激酶之间的作用模式非常复杂。因此，我们需要进一步的对其激酶的动力学作用模式进行评价。根据抑制剂与激酶之间的作用特点不同，我们通常将抑制剂作用分为可逆性抑制剂和不可逆性抑制剂两大类，而可逆性抑制剂又大致可分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合型抑制等。目前已知的酪氨酸激酶抑制剂大多数是可逆的ATP竞争性抑制剂，近几年来研究者们用分子影像技术发现不可逆性抑制剂和底物竞争性抑制剂具有较好的疗效、较高的选择性和较低的毒副作用[33]。

可逆性抑制与不可逆性抑制：Rabindran等[34]用同位素[14C]标记的HKI-272，证明无论从分子水平还是细胞水平来说化合物HKI-272均是酪氨酸激酶HER-2的非可逆性抑制剂。

ATP竞争性抑制：Gumireddy等[35]用同位素法研究了化合物ON012380对BCR-ABL的ATP竞争性抑制。用[γ-32P]标记ATP，由此来证明化合物ON012380是酪氨酸激酶BCRABL的非ATP竞争性抑制剂。

底物竞争性抑制：Galia Blum等[36]用同位素法研究了化合物AG538对酪氨酸激酶IGF-IR的底物竞争性抑制作用，证实了AG538是IGF-IR的底物竞争性抑制剂。

展望

随着科学技术的发展，21世纪医学已经逐步进入分子医学时代，认识疾病必须从孤立的器官和系统深入到生理和生化的细胞分子水平，揭示疾病细胞分子水平上的细微变化信息，阐明病变组织代谢活性的高低来帮助疾病的诊断、治疗以及药效评价。肿瘤组织血供丰富，代谢能力增强，耗能也增加，分子影像技术检查常用分子探针了解肿瘤在糖、脂肪和蛋白质方面的代谢活跃程度，从而对良、恶性肿瘤进行鉴别诊断。这种检查技术对肿瘤的分级、疗效观察以及放射治疗和化疗所致坏死与肿瘤复发的鉴别诊断都有较高的临床价值。分子影像技术在小分子酪氨酸激酶抑制剂开发中的巨大临床价值和发展潜力已得到广泛的认可并在开发新型的靶向酪氨酸激酶抑制剂中展现出巨大的应用前景。

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