干细胞及其诱导技术在培育成体细胞、筛选药物和移植实验中的作用

涂雪松

(北京脑血管病医院 神经科, 北京 100039)



干细胞及其诱导技术在培育成体细胞、筛选药物和移植实验中的作用

涂雪松*

(北京脑血管病医院 神经科, 北京 100039)

利用干细胞及其诱导技术在实验室内培育出的成体细胞，可以为干细胞的基础研究及未来开展的针对人类疾病的临床移植试验创造条件。此外，干细胞及其诱导技术在药物筛选中也能发挥积极的作用。

干细胞；诱导多能干细胞；胚胎干细胞；神经干细胞；成体细胞

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSc)技术是一种利用重编程技术将人体的组织细胞转化为干细胞的技术。iPSc技术的诞生不但解决了干细胞培育的来源细胞问题，而且，通过建立的疾病的动物模型，有力地推动了对人类疾病的发病机制和药物筛选的研究。现在，科学家们已能利用干细胞诱导技术培育出大部分成体细胞。通过导入细胞因子，将胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESs)和iPSc转化为内胚层祖细胞(endodermal progenitor cells, EPCs)，然后再将这些EPCs转化为肝、胰腺、胰岛、肠道等内胚层细胞[1]。利用这些培育出的成体细胞，开展了对人类疾病的基础及临床研究。现在，人类在干细胞及其诱导技术方面的研究已经取得了初步成果。

1 成体细胞的培育

1.1 角膜缘细胞

将皮肤干细胞诱导分化为角膜缘干细胞(limbus stem cells，LSCs)，再把这种重编程的细胞移植到LSCc缺乏的一个成功模拟了人类的角膜损伤的兔子眼睛模型中去，移植细胞既补充了角膜细胞，同时也修复了受损的角膜表面[2]。

1.2 视网膜细胞及色素上皮细胞

利用一种人体干细胞在实验室内培育出视网膜感光细胞(大部分是圆柱细胞)，然后培育出微型人类视网膜[3]。首次利用反转录病毒将人成纤维细胞转化为视网膜色素上皮细胞[4]。将人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)分化为视网膜色素上皮细胞，然后将500 000个提纯的视网膜色素上皮细胞注射到患老年黄斑变性和眼底黄色斑点症(stargardt disease)患者的视网膜下，4个月后，发现患者视力改善，未有癌变和排斥反应发生[5]。 将小鼠的视网膜前体细胞移植到盲鼠眼内，2周后，12只移植鼠中有10只移植鼠恢复对光反应[6],在移植小鼠的视网膜上形成了完整的光敏感层,研究人员计划用iPSc诱导出视网膜干细胞，再诱导出视网膜细胞。

1.3 心肌细胞

用心律失常性右室发育不全/右室下降病患者的皮肤细胞，经过iPSc阶段，培养出心肌细胞，并在实验室制作出心律失常性右室发育不全/右室下降病模型[7]。通过对两个小分子化合物的操作，影响Wnt通路，高效率(80%)地将人干细胞转化为心肌细胞[8]。

1.4 内耳感觉上皮细胞

将人类ES转化为内耳毛干细胞(stem cells，SCs)，分离出未来要分化为螺旋神经节的SCs，将其移植到耳神经受损的沙鼠内耳中，10周后，耳聋沙鼠听到了声音[9]。

1.5 神经系统细胞

通过筛选，研究人员找到了一种能激活骨髓干细胞特定受体的抗体，将其加入到体外培养的人骨髓干细胞中，发现培养皿中的细胞开始增殖，检测表明为神经前体细胞[10]。利用11种转录因子将胚胎小鼠皮肤细胞直接转化为神经前体细胞，随后这些神经前体细胞转化为神经系统各类细胞如神经细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞。将这些神经系统细胞移植进小鼠脑内后发现，它们整合到宿主脑内，并产生出在神经冲动中起重要作用的蛋白质[11]。

1.6 肝细胞

将人iPSc诱导成肝细胞，再将其与人脐静脉内皮细胞和人间充质干细胞混合培养，结果生成了具有血管的肝芽。这种肝芽具有人类肝脏的许多特点[12]。通过导入FOXA2及HNF1α将人ES和iPSc转化为肝细胞样细胞，经检测，这些肝细胞样细胞和原代肝细胞在功能上没有差异[13]。

1.7 肌肉细胞

美国杜克大学的生物医学工程师通过为肌肉干细胞创建微环境，在实验室中培养出了看上去与真实肌肉非常相似的组织工程骨骼肌，将其植入小鼠体内后，其很快就可与机体融合，能像原生的新生骨骼肌一样强力地收缩[14]。

1.8 骨细胞

借用iPS技术，将人体皮肤细胞诱导成骨前体细胞及骨SC，然后种在一个支架上，在生物反应器内进行培养,然后将培养物移植到免疫系统受损大鼠的皮下，12周后发现骨SCs完全转化为成熟的骨细胞[15]。

1.9 脂肪细胞

成功地将人体iPSc高效率(90%)地转化为脂肪细胞[16]。

1.10 胰岛细胞

据报道，最初只能将iPSc培育成胰岛β前体细胞，后来通过改进培育方法，可以直接将iPSc培育成胰岛β细胞。向免疫缺陷糖尿病模型大鼠移植入ESCs，再停止向其注射胰岛素，4个月后，实验大鼠在喂食大量糖的情况下，血糖仍然正常，说明干细胞已转化为胰岛β细胞[17]。将ESCs和iPSc转化为胰岛β细胞，但这种工程胰岛β细胞的功能只及正常胰岛β细胞的20%[1]。

1.11 生发细胞

利用iPS技术，分别将来自实验鼠和人的皮肤细胞培育成毛囊，然后将其分别移植到实验大鼠的皮肤上，结果长出毛发，而且毛发脱落后，可以再长出新毛发[18]。

1.12 成釉细胞

将大鼠齿源性上皮细胞与小鼠iPSc共同培养，结果发现，有95%的iPSc转化为成釉细胞[19]。

1.13 血液细胞

筛选出4 个转录因子，加入培养液中，对取自实验小鼠的成纤维细胞进行培养，结果将成纤维细胞转化为造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，这些HSC类似于人体HSC，分化为包括红细胞、白细胞和血小板在内的血液细胞[20]。通过向人或实验小鼠皮肤中的成纤维细胞植入3个基因，不经过iPSc阶段，17d就将成纤维细胞转化为血小板细胞[21]。

1.14 生殖细胞

在实验室将从成年女性卵巢获得的卵SC(表达干细胞特有的DDX4标记)诱导成卵母细胞(oocyte)，将其移植入小鼠体内，这些卵母细胞分化成为成熟的卵细胞[22]。将小鼠的ESC和iPSc转化为外胚层细胞，再转化为原生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)。待PGCs生成了卵巢样组织后，再其移植到雌性小鼠体内。4周后，卵母细胞发育生成。待受精及胚胎形成后，将其移植到代孕小鼠体内，产下的后代具有生育能力[23]。

1.15 血管细胞

利用皮肤细胞培育出部分诱导多能干细胞(part of the induced pluripotent stem cells，PiPSc)，再用PiPSc培育出血管细胞[24]。先分别将人ES和iPSc转化为人多能干细胞(human pluripotent stem cells，hPSCs)，然后将其与提供相关物质的神经细胞共同分化，培育出具有血-脑脊液屏障功能的血管内皮细胞[25]。

2 筛选药物

通过iPS技术，建立了有TDP43基因突变的运动神经元病的iPS模型，然后进行药物筛选，发现漆树酸(Anacardic Acid)能抑制TDP43蛋白质的蓄积，还发现添加了漆树酸后，运动神经元的突触长度发育到正常水平[26]。TDP43蛋白质的蓄积是运动神经元病的发病机制。漆树酸是一种组蛋白乙酰转移抑制剂。试验结果显示，漆树酸可能是未来治疗运动神经元病的药物。因为该实验是患者的自体移植实验，因此更具有意义。建立了有SMN基因突变的脊髓性肌萎缩病(spinal muscular atrophy, SMA)小鼠模型，用特殊设计的寡核苷酸链对突变的SMN基因进行修复，发现修复后，SMN突变特异性表型不再出现，将其移植入SMA模型小鼠体内，发现SMA模型小鼠寿命延长[27]。这一发现为未来研究SMA药物提供了方向。SMN蛋白是人的运动神经元的生存蛋白，在SMA中，其含量降低，导致运动神经元数量和体积减少。在建立的雷特综合征(Rett syndrome，RTT)人iPS模型上进行了药物试验，发现胰岛素生长因子1(insulin growth factor 1, IGF1)和一定浓度的庆大霉素(100 μg/mL)可以消除RTT的异常表型，表明IGF1和庆大霉素是未来可能的RTT的治疗药物。在建立的SMA模型小鼠上进行了药物试验，结果发现，丙戊酸和妥布霉素可以上调SMN基因的表达，增加SMN蛋白的含量，说明丙戊酸和妥布霉素是未来可能的SMA的治疗药物。纤维母细胞生长因子2(fibroblast growth factor，FGF2)蛋白具有促进肌肉SC分化为肌肉细胞的功能，肌肉中FGF2蛋白含量越高，肌肉内的SC数量越少，FGF2蛋白抑制剂可以通过降低肌肉中FGF2蛋白含量，抑制肌肉SC向肌肉细胞转化，阻止肌肉内SC数量的进一步下降[28]。β淀粉样蛋白(Aβ)沉积导致的老年斑和神经纤维缠结是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)AD的病理改变。建立了家族性阿尔茨海默病(familiar Alzheimer’s disease, FAD)的iPSc动物模型，利用FAD-iPSc动物模型进行了药物筛查，结果发现，γ分泌酶抑制剂能够降低FAD-iPSc分化神经细胞的β淀粉样蛋白42(Aβ42)和β淀粉样蛋白40(Aβ40)的水平，说明，γ分泌酶抑制剂是治疗AD的药物[29]。利用建立的AD患者的特异性iPSc模型对AD的治疗用药进行了筛选，结果发现，β、γ分泌抑制剂或非甾体类抗炎药可以抑制由AD-iPSc转化的神经细胞产生的Aβ[30]，说明，β、γ分泌抑制剂或非甾体类抗炎药是对AD有治疗效果的药物。建立了不同AD患者的iPSc动物模型，然后观察其对药物的治疗反应，不同药物可以引起不同的反应[31]，说明，AD的药物治疗效果存在个体差异。

通过干细胞诱导技术，筛选出一种β-分泌物抑制剂的药物，该药能恢复耳聋小鼠的听力[32]。该药是Notch蛋白抑制剂。Notch蛋白是毛细胞周围的支持细胞表面的蛋白。其的作用机制是使支持细胞发生重编程，转化为毛细胞。这一成果，在未来人类的耳聋治疗应用上有光明前景。

3 移植试验

近期开展的动物模型试验已初步显示出干细胞移植在人类难治性疾病中的治疗效果。

3.1 移植胶质细胞，提高智力及认知功能

将人类胶质细胞移植到大鼠脑内，发现移植大鼠在成长过程中表现出更好地学习能力[33]。人体胶质细胞在智慧和认知能力方面扮演着一个重要角色。研究者认为，这将为研究和治疗与智力及认知能力有关的神经疾病提供了一个切入点。

3.2 使用功能化胶原支架，治疗脊髓损伤

脊髓损伤后产生的大量髓鞘相关抑制蛋白是抑制神经干细胞向神经细胞转化的重要障碍，也是脊髓损伤难治的关键所在。将承载神经干细胞的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)抗体功能化的胶原三维支架移植到脊髓半横断模型大鼠的缺损处，模型大鼠的运动功能得到满意的恢复[34]。功能化胶原支架上的EGFR抗体西妥昔(cetuximab)通过阻断髓鞘相关抑制蛋白信号通路，抵消髓鞘相关抑制蛋白对神经干细胞分化的抑制作用，促进移植的神经干细胞向神经元转化。功能化胶原支架还促进神经细胞生长和突触形成。两者共同作用，使脊髓损伤模型大鼠得到了的修复。

3.3参与肿瘤的过继免疫治疗，增强过继免疫治疗效果

肿瘤的过继免疫治疗就是将肿瘤患者的T淋巴细胞在体内扩增，然后回输给患者。但在体外将T淋巴细胞进行大量扩增有一定困难。先将恶性黑色素瘤患者的T淋巴细胞在实验室转化为iPSc，然后对iPSc进行扩增，再将扩增后的iPSc转化为T淋巴细胞[35]。这样做的好处是既大量开发出T淋巴细胞，又使开发出的T淋巴细胞像以前的T淋巴细胞一样，对癌细胞具有攻击性。通过iPSc技术，将T淋巴细胞转化为iPSc后，T淋巴细胞能通过改变基因排列的方式，将对癌细胞的特异性蛋白的“记忆”传递给iPSc；将iPSc再转化为T淋巴细胞后，iPSc又能将这种“记忆”传递给T淋巴细胞。干细胞的参与既解决了T淋巴细胞大量培育的难题，又保持了T淋巴细胞对癌细胞的攻击性。

3.4 参与肿瘤的化疗，增强化疗效果

以昆虫杆状病毒为载体，将单纯疱疹病毒胸苷(一种自杀基因)导入到来源于人类iPSc的神经干细胞(neural stem cells，NSC)内，将NSC注射到乳腺癌模型小鼠体内，再将抗癌药更昔洛韦(ganciclovir)注射到乳腺癌模型小鼠体内，在原发灶和转移灶内都发现有iPSc-NSC，与未注射iPSc-NSC的乳腺癌模型小鼠相比，生存期延长(由34 d延长至39 d)[36]。

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The role of stem cells and inducing technology in breeding adult cells, screening drugs and the basic research and transplantation

TU Xue-song*

(Beijing Cerebrovascular Disease Hospital, Beijing 100039, China)

Stem cells and inducing technology for adult cells is the basis of stem cell research and clinical transplantation test to potential treatment of human diseases. In addition, stem cells and inducing technology can play a role in drug screening.

stem cells; induced pluripotent stem cells; embryonic stem cells; neural stem cells; adult cells

2014- 05- 14

：2014- 09- 26

*通信作者(correspondingauthor)： txss-888@163.com

1001-6325(2015)02-0273-05

短篇综述

R 318

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