M3受体激动剂诱导大鼠腮腺细胞内AQP5和脂质筏的核转位

王 頔，秦 臻，周党侠，张海峰

(1.西安交通大学 医学部 病理学系，陕西 西安710061；2.陕西省妇幼保健院 生殖中心，陕西 西安710003)



M3受体激动剂诱导大鼠腮腺细胞内AQP5和脂质筏的核转位

王 頔1*，秦 臻1,2，周党侠1，张海峰1

(1.西安交通大学 医学部 病理学系，陕西 西安710061；2.陕西省妇幼保健院 生殖中心，陕西 西安710003)

水通道蛋白5(aquaporin, AQP5)存在于唾液腺腺泡细胞内，对调节水分转运速率和维持唾液分泌具有重要作用，AQP5功能失调会导致如增龄性口干、头面部放疗口干症、SS综合征和糖尿病口腔干燥等相关疾病的发生[1]。研究表明，M3毒蕈碱乙酰胆碱受体(M3 muscarinic acetylcholine receptor, M3-mAChR)激动剂西维美林(cevimeline)可以诱导AQP5与脂质筏(lipid raft)从胞内囊泡转移至细胞顶膜(管腔侧细胞膜)，通过增加膜上蛋白的数量而快速调节对水的通透性[2]。本研究是明确M3-mAChR活化后，AQP5是否与脂质筏首先转位至细胞系。

1 材料与方法

1.1 材料：SPF级8周龄雄性Wistar大鼠，体质量180～210 g，西安交通大学医学院实验动物中心提供(合格证号：医动字第08005号)。兔抗AQP5和羊抗flotillin- 2抗体(Santa Cruz公司)，兔抗GM1抗体(Calbiochem- Novabiochem公司)，羊抗兔Alexa- 488、鸡抗羊Alexa- 594荧光二抗和封闭用的正常血清(北京中杉金桥生物公司)。

1.2 免疫荧光双标：大鼠随机分为6组(n=5)：对照组及西维美林注射后1.5、3、6、10和60 min不同时间点处死组。经大鼠尾静脉按5.0 mg/kg注射西维美林，腮腺组织冷冻包埋。7 μm冰冻切片冷乙醇固定30 min后。分别滴加兔抗AQP5(1∶1 000稀释)和羊抗flotillin- 2(1∶500稀释)一抗，4 ℃过夜。PBS振洗后，再加入1∶500稀释的羊抗兔Alexa- 488和鸡抗羊Alexa- 594荧光二抗避光1h。50 g/L的PI孵育1 h染细胞系。无荧光缓冲甘油封片后，激光共聚焦显微镜照相分析。以PBS替代一抗作为阴性对照。

1.3 腮腺细胞细胞系的分离：大鼠尾静脉注射0.9%氯化钠注射液或者西维美林3 min后，取腮腺组织至0.32 mol/L的蔗糖缓冲液中，600 ×g离心10 min。沉淀清洗两次后悬浮，调节悬液浓度至1.89 mol/L，置于离心管2.2 mol/L蔗糖缓冲液上，75 000 ×g离心90 min，得到细胞系沉淀。

1.4 去垢剂可溶和不溶片段的制备：细胞系溶解在包括1% TX- 100的TNE缓冲液中(25 mmol/L Tris-HCl[pH 7.4],150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA)，冰上放置30 min。4 ℃ 200 000 ×g离心30 min，分离去垢剂可溶和不可溶片断。

1.5 Western印迹：细胞系和去垢剂可溶及不溶成分在12.5% SDS-PAGE凝胶中电泳，待样品分离后电转移至硝酸纤维素膜上，13 V转膜25 min。5%牛血清白蛋白封闭1 h，分别与抗AQP5和GM1抗体(1∶1 500)孵育1 h，TBST洗膜3次。二抗(1∶4 000)孵育1h后，洗膜，ECL显色。β-actin为内参照计算相对表达量。

2 结果

2.1 西维美林诱导AQP5向细胞系和细胞顶膜的运输：静息状态下，AQP5弥漫分布在胞质和细胞顶膜；西维美林注射1.5～3 min后，AQP5定位在细胞系；6～10 min后，AQP5主要定位在细胞顶膜，60 min后，AQP5在细胞顶膜的水平下降，弥散入胞质(图1)。

2.2 AQP5和脂筏运输到细胞系和细胞顶膜：静息条件下，AQP5和脂质筏的标志物脂筏结构蛋白2(flotillin2)共定位在胞质和细胞顶膜，西维美林注射3 min后，AQP5和脂筏结构蛋白2出现在细胞系内和细胞顶膜，60 min后AQP5和脂质筏从胞核消失，重新回到胞质(图2)。西维美林注射3 min后，AQP5和脂质筏的另一标志物GM1在细胞系内的水平明显上升(P<0.05)(图3A)。AQP5在无刺激条件下，主要呈现在细胞系去垢剂不溶片段内，西维美林作用后，细胞系内的AQP5在去垢剂可溶和不溶成分内均增加(P<0.05)，而GM1的水平仅在去垢剂不溶的片段内增加(P<0.05)(图3B)。

A.control group; B～F.1.5,3,6,10 and 60 min after cevimeline-injection; arrow shows AQP5 in the nuclei 图1 免疫荧光检测西维美林注射后腮腺组织内AQP5的变化

A.overlap of AQP5(Alexa- 488, green) and flotillin- 2(Alexa- 594, red); B.magnification of A; C.higher magnification of B; arrows shows AQP5 in the nuclei

3 讨论

AQP5是一种细胞膜转运蛋白，对调节水分转运速率和维持唾液分泌具有重要作用，定向的胞内转运是确保其发挥生理功能的重要调节方式。脂质筏是膜脂双层内含有特殊脂质和蛋白质的微区域，4℃时不溶于非离子去垢剂Triton X- 100，涉及信号传导，蛋白分选和运输等细胞活动。已有研究表明，西维美林可以诱导AQP5和脂质筏从胞内囊泡转移至细胞顶膜，快速调节对水的通透性[2]。

*P<0.05 compared with control group图3 AQP5和GM1在细胞系内的分布Fig 3 Distribution of AQP5 and GM1 in isolated nuclei

本研究结果显示，西维美林刺激后1.5～3 min内，AQP5出现在细胞系内，并且和脂质筏共定位，6～10 min后，转位到细胞顶膜，之后逐渐内化入胞质。说明AQP5和脂质筏在刺激状态下首先转位至细胞系，接着移动到细胞顶膜。西维美林刺激后，分离的腮腺细胞系内AQP5和脂质筏特异标志物GM1水平明显上升，且都主要出现在去垢剂不溶的片段内，去垢剂可溶片段内AQP5含量虽然在刺激后有所升高，但是明显低于不溶片段。提示AQP5主要定位于去垢剂不溶的脂质筏内，并受其调节共同从核外转移至核内。已知氯离子通道蛋白27(NCC27)出现在细胞系内，调节氯离子在核膜上的进出[3]。有关AQP5迅速转位至细胞系的作用及是否涉及细胞系内水的转运和DNA合成等过程，还有待深入研究。

[1] Delporte C. Aquaporins in salivary glands and pancreas[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1840: 1524- 1532.

[2] Wang D, Yuan Z, Inoue N,etal. Abnormal subcellular localization of AQP5 and downregulated AQP5 protein in parotid glands of streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1810: 543- 554.

[3] Valenzuela SM, Mazzanti M, Tonini R,etal. The nuclear chloride ion channel NCC27 is involved in regulation of the cell cycle[J]. J Physiol, 2000, 529：541- 552.

2014- 05- 12

：2014- 06- 22

西安交通大学新教师科研启动经费(DWYXc111000127)

*通信作者(correspondingauthor)：wangdi2011@mail.xjtu.edu.cn

1001-6325(2015)02-0237-03

R 333.1

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