年龄相关性黄斑变性的动物模型

聂 闯，罗 灵，张卯年解放军总医院 眼科，北京 0085；解放军医学院，北京 0085；解放军第06医院 眼科，北京000

年龄相关性黄斑变性的动物模型

聂 闯1,2，罗 灵3，张卯年1,2
1解放军总医院 眼科，北京 100853；2解放军医学院，北京 100853；3解放军第306医院 眼科，北京100101

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)已成为65岁以上人群视力损失的主要原因，是一种年龄、基因、环境等多因素共同作用的慢性疾病，首先表现为Bruch膜的损害，随后影响到视网膜色素上皮和光感受器。随着疾病研究的深入，已发现了越来越多的特殊类型，但是其具体发病机制仍不明确。因此研究者们为了更深入地研究疾病以及研发新的治疗手段建立了各种各样的动物模型。我们复习了国内外经典以及较新的动物模型文献，并按不同疾病类型进行综述，希望为研究者寻找理想的动物实验平台提供思路。

年龄相关性黄斑变性；动物模型；病因学

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是工业化国家65岁以上人群致盲的主要原因[1]。AMD是一种复杂的慢性疾病，涉及到基因、环境等多因素对黄斑结构的共同作用。AMD的发病机制不明，预防和治疗仍面临很大挑战。AMD主要分为干性和湿性两型，以及息肉状脉络膜血管病变(polypoidalchoroidalvasculopathy，PCV)、视网膜血管瘤样增生(retinal angiomatous proliferation，RAP)两个特殊类型。干性AMD比湿性AMD更常见，但是湿性AMD的脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是视力丧失的主要原因[2-3]。动物模型对于研究疾病的发病机制和治疗至关重要。理想的动物模型应具有模型简单、重复性强、经济及短期就能完整重现AMD特征的优势。目前用于AMD研究的动物模型很多，但仍未获得完美的AMD动物模型。本综述将参考以往的AMD动物模型，按不同疾病类型进行综述，力图提供一个综合的动物模型报告，为研究者寻找不同研究目的的理想动物实验平台提供思路。

1 动物的选择

目前已经建立了啮齿类动物、兔、猪和灵长类哺乳动物的AMD模型。尽管啮齿类动物(如小鼠、大鼠等)不具有黄斑结构，但因黄斑是视网膜一部分，类似病变表现同样可发生在视网膜上，且拥有人类90%的同源基因，实验费用低，基因操作简单成熟，同时发病周期较短，有利于我们对AMD疾病特点的观察[4]。而灵长类动物尽管基因操作困难、维持费用高、疾病进展时间缓慢，但具有与人类最接近的解剖结构[4]。并且在多种基因与药物有效性的AMD研究中发现，人与鼠存在差异，而与灵长类动物却具有一致性，这说明了AMD是一种复杂的人猴共患遗传疾病，可能存在着共同发病机制[5]。因而灵长类动物AMD模型的发病机制更加接近于人类。

2 干性AMD的动物模型

黄斑区出现多种小或中等大小的玻璃膜疣(drusen) (≥63μm且≤125μm)是早期AMD的典型病理特征[6]。干性AMD又称为无新生血管性AMD，具有以下眼部特征：大面积Drusen(≥125μm)，视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)改变以及地图状萎缩。研究者从以下多种途径建模，观察到了干性AMD的各种表现，为我们不同因素与AMD相关性的研究提供了思路。

2.1 致病基因模型 目前发现有数种基因的突变能产生黄斑萎缩性损伤或合并有视网膜斑点沉着的AMD，特异性的基因敲除虽然存在基因操作困难、费用高的缺点，但是能获得遗传稳定的特异性黄斑病变模型，采用的方式是将已变性或删除特定疾病相关片段的DNA片段构建成靶向载体，并用电穿孔方式注入胚胎干细胞，将此胚胎干细胞再植入小鼠胚囊内并繁殖，最后用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和DNA印迹法筛选出子代中已删除或具有此变性片段的小鼠，从而获得了由该片段变性或缺失引起的小鼠疾病模型。1)敲除Elovl4 5-bp基因后的E_mut+/-鼠模拟出了RPE的空泡状改变等早期AMD变化，获得了由ELOVL4的延伸变性引起Stargardt样黄斑变性的疾病模型[7]。2)Sorsby眼底退化病(sorsby fundus dystrophy，SFD)是一种罕见迟发性的视网膜和脉络膜变性遗传病，与TIMPS基因突变相关，Timp3-/-鼠能够构建此模型[8]。3)补体调节因子H(complement regulatory gene factor H，CFH)SNP基因多态性与AMD发病有关[9]：Cfh-/-鼠模型视网膜下有Drusen样改变，提示AMD可能[10]。

2.2 易感基因模型 有部分基因虽然不是引起黄斑病变的直接基因，也不会增加AMD的患病风险，但是遭受破坏后动物也会表现出AMD的临床特征[11]。

AMD与炎症的相关性一直被认为是相辅相成的，炎症趋化因子CCL-2与CCR-2结合后能控制组织的渗出，用上述基因技术获得的CCL2-/-和CCR2-/-鼠发生AMD早期表现，甚至出现CNV[12]；而Luhmann等[13]用同样方式却没有得出AMD模型。因此CCL2/CCR2准确通路仍待深入研究。

血浆铜蓝蛋白是一种亚铁氧化酶，人缺乏此蛋白会出现年龄相关的Drusen和视网膜色素变化[14]，第二亚铁氧化酶-Hephaestin能部分弥补其损伤[15]。缺失铜蓝蛋白和Hephaestin基因的小鼠模型[16]，能表现出多种干性AMD病变，晚期还诱发视网膜下的新生血管[17]，然而，由于运动系统紊乱，很多双基因敲除小鼠幼时就死亡，限制了对衰老小鼠的研究。

补体因子C3的过度表达能加速补体活化和视网膜疾病的进展。将转染后表达鼠C3腺病毒注入成年老鼠的视网膜下[18]，表现出RPE萎缩和补体沉积等数种干性AMD的特征，可用于补体参与的疾病与AMD的相关性的研究。

2.3 氧化相关模型 流行病学研究表明，光及吸烟的氧化损伤，将增加AMD的风险[19]。同时经证实，AMD患者具有高水平的脂质过氧化产物[20]。因此，缺乏内在抗氧化机制或给予氧化刺激后动物能表现出AMD的许多特征，可用于研究吸烟以及光损伤与AMD的相关性。

光可诱发视紫红质、脂褐素等感光分子产生活性氧中间体，对视网膜造成损伤[21]。将SD大鼠暴露在1 000 lux明亮光(BCL)持续照射24 h，构造了萎缩性AMD模型[22]。蓝光照射大鼠6 h RPE出现空泡状改变、细胞固缩、坏死等[23]；Sprague-Dawley白鼠暴露眼A2E氧化产物增加诱导AMD的发生[24]。香烟烟雾中也含有许多强氧化剂如一氧化氮，一氧化碳和氢醌。暴露于香烟烟雾或氢醌的小鼠出现早期AMD，部分动物发生了脉络膜毛细血管侵入Bruch膜[25-26]。野生型小鼠饮用含氢醌的水后，RPE和脉络膜上CCL-2表达减少以及VEGF、PEDF比率改变[27]。

Hollyfield等[28-29]用CEP-内收鼠血清白蛋白免疫小鼠进行研究验证氧化损伤产生的CEP内收蛋白引发AMD这一假设：动物出现Bruch膜沉着增厚，RPE、光感受器的病理性改变，无新生血管发生，表明此模型适用于干性AMD。此模型的优点是不需要进行基因操作和特需的照明条件。

氧化应激会引起视网膜的细胞分子损伤，而此时主要的抗氧化系统为超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)：包括SOD1、SOD2和SOD3[30]，视网膜中SOD1活性最高[31]。实验证实了SOD1-/-鼠发生干性AMD表现，衰老后表现更明显[32]。经视网膜下注射AAV核酶介导敲除野生型小鼠RPE的SOD2 mRNA模型[33]，也成功诱导出AMD。此类模型可用于进一步研究不同氧化酶与AMD进展之间的关系。

2.4 饮食模型 众所周知，高糖高脂饮食在心血管疾病中是危险事件[34]，经证实人玻璃膜疣中存在进展期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)[35]。而动脉粥样硬化斑块中胆固醇和脂质的沉积，类似于Bruch膜堆积的物质，因此心血管疾病和AMD患病之间可能存在着相关[36]。进行低血糖指数(glycemic index，GI)喂食的C57BL/6鼠能够预防AMD发生，高GI饮食则能构建一种早期AMD损伤模型[37]。另外高脂肪饮食的C57BL/6小鼠年长后发生了基底层的沉着物[25,38]，这与老年性脂质增高而伴随AMD发生的病程一致。

此外，缺乏类叶黄素和玉米黄素饮食的恒河猴，表现出血管造影窗口缺陷[39]，这与流行病学表明叶黄素和玉米黄素的摄入能够减少AMD的患病风险结论一致[40]。

2.5 其他模型 加速衰老小鼠(senescence-accelerated mouse，SAM)种系是由AKR/J小鼠选择性近交产生的，随后又扩展到9种近交衰老品系(SAMP)和4种抗衰老品系(SAMR)[41]，可以不受动物年龄影响较早出现实验期望的AMD病理改变。其中SAMP1小鼠出现年龄相关的Bruch膜增厚和RPE改变[42-43]；SAMP8小鼠早期发生RPE基底膜微绒毛的断裂，之后出现严重的RPE退化[42]。

3 湿性AMD

CNV是渗出性AMD的标志性病变，也是老年人视力丧失的一个重要原因[9]。目前大多数动物模型制作依赖于激光或RPE/Bruch膜复合物的直接机械损伤或网膜下腔注射外源性化合物。

3.1 激光损伤模型 激光造模能很快地诱发新生血管[44]，还具有定量、重复性好、容易观察等优势，在CNV研究中应用较广。用激光破坏Bruch膜诱导CNV最早应用于灵长类动物，特别是断尾的短尾猴(猕猴属)(Macacaspeciosa)[45]。近期对非洲绿猴的激光参数研究表明，750 mW和950 mW激光分别可产生72.9%和69.4%的Ⅲ级损伤；950 mW和1 500 mW激光产生Ⅳ级损伤的发生率分别为19.4%和31%[46]。40%激光损伤眼出现了血管生长和Ⅳ级渗漏[47]，此模型为激光损伤研究分级提供了参考。然而，激光造模最多的动物却是啮齿动物。早在1989年Dobi等[48]第一次用氪激光对大鼠造模时认为，120 mW的激光能有效诱导Bruch膜断裂并产生CNV。近期的Askou等[49]使用绿光氩激光诱导小鼠CNV，认为光凝部位出现气泡时为Btuch膜断裂标志，利于CNV的形成。大鼠和小鼠激光后CNV的发展时间相似，第一周为早期阶段，10～14 d发展为成熟膜[50-51]。但啮齿动物激光创伤模型也许不能反映人类疾病诱发CNV的一系列复杂动态过程。此外，啮齿动物还与人还存在黄斑解剖差异。激光模型所造成的细胞反应与人发生CNV时新生血管变化相似，但是这种机械性损伤导致的CNV是迅速的，而且是自限性的，往往伴有视网膜不可逆的灼伤[52]。

3.2 视网膜下注射模型 视网膜下注射多采用自睫状体扁平部进针，通过玻璃体达到视网膜下，注射诱发CNV的物质。因为血管内皮生长因子在新生血管性CNV中的核心作用早已确定[53]，但VEGF蛋白的作用时间段，单纯注射VEGF蛋白是不能建立可用的动物模型。为了达到持续表达的目的，Baffi等[54]和Spilsbury等[55]制备了表达VEGF的腺病毒载体从而成功塑造了CNV模型。

除了病毒载体，基质胶也是常采用的方法。基质胶是一种注入体内后能转化为固体并缓慢释放血管生成因子的蛋白混合物[56-57]。基质胶单独注射或联合VEGF注射，产生100%的CNV病变，并能成功模拟出人渗出性AMD中参与新生血管反应的相似细胞组分[58]。Drusen含有补体成分且与CFH有关[59]，因此通过注射能活化视网膜下补体系统的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG-8)创建新的CNV模型：第3天新生血管即可穿透Bruch膜，第5天出现完整的新生血管和视网膜退化[60]。最近罗灵等[61]发现了视网膜光感受器和角膜无血管特性的重要保护因子，即VEGF受体1(sFlt-1)，利用其可降低VEGF血管生成的作用，通过视网膜下注射携带shRNA序列靶向敲除sFlt-1的腺病毒载体后，诱发了CNV。这种CNV在眼内长期存在，并在注射后6周左右，在远离注射部位的正常视网膜也出现继发性CNV，可排除注射产生机械性损伤的干扰。

3.3 基因模型 缺乏IL-27的EBI3缺陷小鼠，在激光损伤后，比C57BL/6小鼠表现出更多的CNV[62]，因而能更加容易快速地制备动物模型。罗灵等[61]用条件靶向基因敲除的方法，成功制备了转基因CNV的动物模型，通过VMD-Cre与Flt-1 loxp/loxp鼠杂交，靶向敲除色素上皮细胞的VEGF受体1，诱导出CNV模型。此种CNV发病年龄早(＜28 d)，CNV的病灶大小不一[61]。此方法能够在遗传水平纯化稳定的提供CNV模型，不用筛选即可直接进行药物等干预实验。

3.4 手术模型 Bruch膜的破坏是新生血管形成的必要条件[63]。Kiilgaard等[64]将Danish Landrace猪眼RPE进行手术切除，并对Bruch膜行机械化损伤，诱发了CNV。而有研究发现，不先行RPE清除的Bruch膜穿孔处理是诱导CNV发生的最可靠方法[65]。此外，脉络膜上腔是血管生成物质的传递和基因治疗载体的另一个潜在空间[66]。Zahn等[47]经巩膜切口用睫状体分离铲进入兔眼脉络膜上腔并植入浸润有VEGF颗粒，在第2周出现新红色的CNV和渗漏。虽然手术模型具有减少神经视网膜损害的优势，但该技术成本较高，且受熟练的手术操作的限制。

4 特殊类型PCV和RAP

PCV以内层脉络膜出现非正常的囊样薄壁血管扩张是其主要特征[67]。因为PCV为一种特殊的亚型，因此此类动物模型较少。2008年，Lee等[68]研究发现，HTRA1的rs11200638的单核苷酸多态性与华人PCV的危险高度相关。Jones等[69]通过给鼠表达人HTRA1的转基因处理后，诱导出了PCV的主要病理特征：脉络膜分支血管网，息肉状病变，脉络膜血管弹力层和中膜的衰退。衰老的HTRA1鼠发生了隐蔽的CNV。实验结果表明，HTRA1的增加足够诱发PCV，同时也是CNV的一个重要的危险因素。

RAP占新生血管性AMD患者的12%～15%，主要表现为神经视网膜自身血管的增殖，逐渐向视网膜下生长合并或不合并色素上皮的脱离，最终产生CNV[70]。大家都希望基因缺陷模型能够带来遗传稳定的实验动物来源：极低密度脂蛋白受体基因的敲除和突变模型成功模拟出了RAP，因其激活视网膜血管内皮细胞且促进体内外的血管生成[71]。CCDKO鼠模型(Ccl2/Cx3cr1双基因敲除小鼠)视网膜外核层下早期即出现类似于视网膜毛细血管扩张的病理改变[72]。靶向敲除光感受器的VEGF受体1，也能诱导出RAP模型[61]。

5 结语

不同模型具有不同的特征和局限。激光模型具有快速成模、定量、重复性好、容易观察等优势，视网膜下注射模型多用于某种基因或细胞因子的功能学的研究，但是这两种模型需熟练的显微操作技术，且同时机械性外伤本身能诱发新生血管，因此与人自发AMD的病理机制是相背离的。基因模型因能自发产生AMD，排除了物理性损伤因素，因此更接近AMD的发病特点并能直接体现相关基因的功能，但是造模技术复杂，形成CNV的时间长短各异。饮食或环境干预可以评估不同的风险因素，但是存在造模耗时相对长的局限。这些模型都为黄斑变性研究提供巨大帮助，研究者可以根据实验目的从中选择适合的动物模型。

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Animal models in research on age-related macular degeneration

NIE Chuang1,2, LUO Ling3, ZHANG Maonian1,2
1Department of Ophthalmology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Chinese PLA Medical School, Beijing 100853, China;3Department of Ophthalmology, The 306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China

ZHANG Maonian. Email: zmn301@sina.com; LUO Ling. Email: ling.luoling1208@gmail.com

Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the individuals older than 65 years. It is a complex chronic disease influenced by age, genetic and environmental factors. AMD begins in Bruch's membrane and progresses into the retinal pigment epithelium and ultimately the overlying photoreceptors. It has several subtypes. Its etiology still remains unclear and its therapy is still a big challenge. Recently, there are several AMD animal models have been established for research. This article reviews these diversity of animal models, both on their advantages and limitations, in order to provide some details for further study.

age-related macular degeneration; animal models; etiology

R774.5；R-331

A

2095-5227(2015)03-0294-05< class="emphasis_bold">DOI：1

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.03.026

时间：2014-11-27 10:43

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141205.1041.002.html

2014-07-11

国家自然科学基金项目(81271016)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81271016)

聂闯，女，医师，在读博士。研究方向：玻璃体视网膜疾病。Email: liz137@163.com

张卯年，博士，教授，主任医师，博士生导师。Email: zmn301@sina.com；罗灵，女，副主任医师，出站博士后。Email: li ng.luoling1208@gmail.com