外泌体的生物学特性及临床应用的研究进展

李 晓，刘玲英，柴家科

解放军第一附属医院 全军烧伤研究所，北京 100048

综 述

外泌体的生物学特性及临床应用的研究进展

李 晓，刘玲英，柴家科

解放军第一附属医院 全军烧伤研究所，北京 100048

外泌体是由细胞内涵体分泌的小囊泡，在细胞间信息传递中扮演重要角色。外泌体可通过受体介导的交互作用直接刺激靶细胞，或通过向靶细胞转移各种生物活性分子如膜受体、蛋白质、mRNA和microRNA等方式发挥其生物学功能。随着相关技术的完善，越来越多的研究将目光投向了利用外泌体进行疾病的诊断、预后及治疗临床应用。本文就其研究现状和临床应用做简要综述。

外泌体；细胞学；生理病理

近年来，细胞外小囊泡逐渐引起研究者的浓厚兴趣，随着2012年细胞外囊泡国际学会的成立，更加奠定了其重要地位。细胞分泌的膜性小囊泡有许多种，包括外泌体(exosomes)、脱落微泡(shedding microvesicle)、微球(microparticle)以及凋亡小体，它们虽成分不同，但均能介导细胞间的物质传递与信息交流[1]。提高对细胞外小囊泡的认识，不仅有助于进一步了解细胞的基本生理代谢和病理改变，而且对临床疾病的诊断与治疗也有重要的指导意义。外泌体是目前公认功能较强、研究较多的一类小囊泡。

1 外泌体简介

1.1 外泌体生物特点 外泌体直径40 ～ 100 nm，表面富含胆固醇、神经鞘磷脂、神经酰胺等脂类物质，其内载有蛋白质、mRNA、microRNA等生物信息，在细胞微环境中发挥重要作用[2]。1983年Johnstone等[3]首次发现羊成熟网织红细胞可释放一种膜性小囊泡，最初这种小囊泡被认为是用来排出多余的转铁蛋白受体，并将其称为外泌体。1996年在B淋巴细胞中也发现了外泌体，且这些外泌体具有刺激T细胞增殖、抑制肿瘤生长等重要生物学活性[4]。随后研究者发现除了体内活细胞，在体外培养的不同类型细胞中也能检测到外泌体，如树突状细胞、上皮细胞、血小板、肿瘤细胞、间充质干细胞等[5]。接下来研究者又惊奇的发现，外泌体广泛存在于任何体液中，包括唾液、血液、尿液、脑脊液，以及胸水、腹水等，这说明外泌体不仅是细胞正常生理病理代谢的产物，且分泌外泌体是一种普遍的细胞功能[6]。

1.2 外泌体的形成 为了区别外泌体与细胞代谢中产生的其他膜性小囊泡，研究者利用脉冲追踪与电镜鉴定发现，外泌体是经由内体途径生成[7]。细胞内晚期内体的界膜多处凹陷，向内出芽形成管腔状囊泡，从而转变为具有动态亚细胞结构的多囊体(multi-vesicle bodys，MVBs)。MVBs是真核细胞重要的蛋白运输与分拣中心，并与信号传导、细胞质分裂、基因沉默、自噬、病毒出芽等过程密切相关。当MVBs与溶酶体融合后，其内的管腔状囊泡发生降解；而与胞膜融合后，其内的管腔状囊泡再次凹陷以内出芽方式形成颗粒状小囊泡，并释放入细胞外环境，即外泌体[8]。外泌体的生成是一个连续性的过程，某些类型的细胞如血小板经活化刺激后可增加外泌体的释放，其他因素如自由基压力、UV放射、膜胆固醇含量降低及胞内钙离子水平升高等也能增加外泌体的含量[9-10]。

经过两次内出芽，内体中各种物质被分选后载入外泌体。不同细胞来源外泌体表面携带有相似的保守蛋白，如CD9、CD63、CD81、Alix、Tsg101等，其内则分别含有与其来源细胞相关的特异性生物学物质[11]。这些物质不仅能反映其来源细胞类型(如成熟网织红细胞来源外泌体含有大量转铁蛋白受体，而淋巴细胞或树突状细胞来源外泌体中则含量较少)，更重要的是还与其来源细胞的生理功能或病理改变密切相关(如肿瘤细胞来源外泌体既含有肿瘤抗原又含有肿瘤特异性microRNA)[12]。

1.3 外泌体内载物的分拣与运输 在MVBs的形成过程中涉及了20多种囊泡分拣蛋白，其中最重要的是4种内体运输分拣复合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)和液泡蛋白分选因子(vacuolar protein soaing 4，Vps4)。ESCRT是一种细胞膜塑形蛋白，能识别泛素化修饰的膜蛋白，介导内吞小泡出芽和MVBs形成，从而促进外泌体的产生[13-14]。其中，ESCRT0与包含素在内体膜上形成微域并富集泛素化的载体蛋白。ESCRTⅠ和Ⅱ型诱导MVBs出芽形成外泌体，并分拣蛋白加载入外泌体中。ESCRTⅢ型收缩及剪切芽颈帮助外泌体膜脱落。Vps4则可解离ESCRT以便其循环再利用。而泛素化及泛素化蛋白具有修饰或调控ESCRT的定位和功能的作用[15-16]。因此，ESCRT、Vps4及泛素化蛋白在内体上的衔接协同作用是促进MVBs形成、载体蛋白质分拣及外泌体生成的重要因素。当ESCRT亚结构或Vps4功能失活后，载体蛋白被不断运输进来与ESCRT一起蓄积在内体上，却不能被正常分拣排出，从而导致内体膨胀变形，阻断MVB形成途径，最终无法产生外泌体。

由于内体是真核细胞中一种膜结合性的分隔体，为各种物质在被溶酶体降解前提供了一个可被分拣的环境，来自胞膜或高尔基体的物质到达内体后可与溶酶体结合发生降解，也可再循环至胞膜。因此在运输过程中，内体中的蛋白能够通过循环重新回到原处，或是通过聚集被后期分隔并包裹进外泌体。

2 外泌体的生物学功能

2.1 外泌体的作用途径和方式 外泌体由来源细胞释放入外环境后，距离较近的可由近分泌途径直接被受体细胞吸收，距离稍远的可由旁分泌途径被吸收，还有部分外泌体循环入体内作用于全身系统由内分泌途径被吸收。对于近距离的吸收，起初认为外泌体是与受体细胞非特异性结合发生胞膜融合后进入细胞。但近来发现这一过程与受体细胞表面特异性分子(如T细胞膜蛋白Tim4)的调节或受体细胞上4次跨膜蛋白有关，这说明外泌体的摄取并非完全随机发生。外泌体被受体细胞吞噬后可到达吞解体，也可到达晚期内体的囊腔中，但外泌体是由吞解体裂解还是由晚期内体释放于受体细胞质中，以及是什么原因导致了这种不同的吸收路线，目前还不清楚。组织特异性是否参与远距离靶向吸收循环系统中的外泌体，仍是另一个潜在的研究方向。

目前认为，外泌体主要通过4种方式在细胞间发挥信息传递作用：1)外泌体作为信号复合物，通过细胞表面配体直接刺激受体细胞；2)外泌体在细胞间转移受体；3)外泌体向受体细胞运送功能蛋白或传染性颗粒；4)外泌体通过mRNA、microRNA或转录因子向受体细胞传递遗传信息[17]。一旦外泌体被受体细胞吸收后，其内载有的脂质、蛋白质、mRNA、microRNA等成分可以通过改变转录和翻译程序影响蛋白修饰和定位，调节信号级联通路、关键酶反应以及细胞自动调节等方式影响受体细胞的细胞表型和功能，而来源细胞和受体细胞的种类及其生理病理状态将决定具体是哪种机制发挥主要作用。

2.2 不同来源外泌体的不同作用 来源于不同细胞的外泌体在不同的生理、病理阶段具有不同的功能。以动脉粥样硬化、心肌梗死为例，在炎症早期，中性粒细胞来源外泌体能刺激抗炎因子IL-10的产生，到了炎症晚期。纤维母细胞来源外泌体则可能引起重组人单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等促炎因子的升高[18]。更重要的是，在整个心肌缺血再灌注过程中，间充质干细胞来源外泌体能有效降低炎症反应，减轻心肌损伤，并促进心肌修复[19]。科学家通过研究发现，血小板和巨噬细胞来源的外泌体聚集在动脉粥样斑块的脂质中心，能促发炎症、血管新生以及血栓形成，这一发现对临床诊治具有指导意义，使外泌体成为一个潜在的治疗靶点[20]。内皮功能障碍被认为是动脉粥样硬化的起始事件，且与其他心血管疾病相关，受损内皮细胞释放的外泌体则可作为一种生物标记物提示疾病严重程度[21]。

正常细胞来源外泌体能改变受损细胞表型及功能，同理病变细胞来源外泌体也能向正常细胞传递有害的生物信息。HIV感染的T细胞和EBV感染的B细胞来源外泌体载有病毒编码物质，细菌感染的细胞来源外泌体含有病原菌，人脑瘤细胞来源外泌体携有脑瘤基因受体EGFRvⅢ亦能转移至正常细胞[22-24]。有趣的是，肿瘤细胞来源外泌体产量较高，尽管目前并不清楚是什么机制引起了或什么需求诱导了外泌体的升高，但这提示外泌体可能参与了肿瘤的发展。

3 外泌体作为生物标记物

外泌体不仅可以反映来源细胞的内容物，还可体现来源细胞的生理病理状态，因而利用外泌体作为生物标记物不仅来源易得、检测方便、变化较早、伤害较小，且由于外泌体膜与来源细胞的细胞膜具有同源性，故利用细胞膜上大量富集的蛋白进行免疫分选能提高诊断率。

由于尿液标本最易获得，因此目前关于生物标记物的研究大多集中于尿液来源外泌体。有研究者发现，急性肾损伤模型尿液来源外泌体的胎球蛋白A含量较正常对照组增加50倍，且较传统标记物尿中肌苷酸更早出现改变[25]。另有一些实验已证实，尿液和肾小球滤过液来源外泌体能在前列腺癌和膀胱癌模型中发挥提示作用。体外培养的膀胱癌细胞来源外泌体包含大约350种蛋白，其中18种存在于膀胱癌患者尿液来源外泌体中，与正常人相比，有8种蛋白高表达，且这些蛋白大多与表皮生长因子信号通路有关。研究者接下来准备利用细胞培养基作为模型观察外泌体对表皮生长因子信号通路的影响[26-27]。此外，还有研究者报道尿液来源外泌体中活化转录因子(activating transcription factor 3，ATF3)可能是急性肾小管损伤的新型生物标记物，肾母细胞瘤抑制基因(wilms tumor protein，WT-1)则可能反映慢性肾疾病相关足突状细胞的损伤，但这些结果是否能最终应用于患者，仍需大样本正规流程的临床试验予以验证[28]。

尽管利用外泌体作为生物标记物具有诸多可喜的优势，但仍有几点需要注意：1)由于外泌体内载物含量较少，因此有效内容物的富集度决定了外泌体作为生物标记物的可行性。2)由于体液样本自身存在蛋白和RNA，因此外泌体的分离和纯化显得尤为重要。3)体液中各种类型细胞来源外泌体也会成为混杂因素，如正常体内提取的血浆外泌体可能来源于红细胞、淋巴细胞或血小板，而与血液循环直接或间接接触的组织细胞包括血管内皮细胞或有窗孔的组织包括胎盘、肝也可能将外泌体释放进入血液，因此对外泌体来源细胞的筛选也非常关键[29]。

4 外泌体作为药物载体

理想的药物载体需能逃避宿主免疫系统，被靶细胞特异性吸收，具有足够时长的循环半衰期，无毒性，且能加载多种不同的药物。因此外泌体作为一种天然的脂质体，被认为较目前广泛使用的人工合成脂质体具有更多优势[30]：1)外泌体内所含的大量蛋白质和遗传信息说明外泌体可被加载大部分生物学物质；2)外泌体广泛分布于人体各种体液，说明其在人体有良好的耐受性，因此外泌体载体的药物在体内可保持一个较长的循环半衰期从而提高疗效[31]；3)外泌体能穿过细胞膜将承载物质运送至靶细胞，如树突状细胞来源外泌体能将主要组织相容性复合体转移到其他树突状细胞从而调节免疫[32]；4)外泌体自身特有定向归巢能力，许多证据显示外泌体的靶向性作用与其细胞来源有关，如黑色素瘤来源外泌体倾向于到达前哨淋巴结以促进肿瘤转移[33]；5)外泌体能进行膜修饰从而增强细胞特异性靶向作用，例如加载了β分泌酶(beta-secretase 1，BACE1)siRNA的外泌体可穿过血脑屏障，将大脑神经元、小胶质细胞和少突细胞中BACE1的mRNA及蛋白表达下调60%左右[34]；6)与传统人工合成脂质体不同的是，外泌体在体内、体外均能加载药物；在体内通过转染将药物加载入来源细胞从而获得目的外泌体；在体外通过电穿孔和脂质转染法将目的药物加载入纯化后的外泌体中[35]。

5 结语

在各种生理和病理过程中，外泌体通过与受体细胞特异性结合并传递各种信息从而发挥了重要的生物学作用。进一步深入研究外泌体独特的生物学结构和功能，不仅为各种疾病提供了一种安全便捷的早期诊断标记物，也为个体生物学治疗提供了一种靶向性策略，还能为未来药物载体的研发开启一条全新的思路。

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Advances in biological characteristics and clinical application of exosomes

LI Xiao, LIU Lingying, CHAI Jiake
Department of Burn and Plastic, the First Affiliate Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China

CHAI Jiake. Email: cjk304@126.com

Exosomes are microvesicles derived from the endosomal compartment of cell. An increasing evidence indicates that exosomes play a pivotal role in intercellular information transmission, and they may directly stimulate target cells by receptormediated interactions or transfer various bioactive molecules including membrane receptors, proteins, mRNAs, and microRNAs to target cells. With the advances in technique, more studies are conducted to the clinical applications of exosomes for diagnosis, prognosis, and therapy. The increased understanding of exosomes reveals a very complex contribution of exosomes to health and disease. In this review, we summarize the current progress and clinical application of exosomes．

exosomes; cytology; physiopathology

R 363

A

2095-5227(2015)10-1042-04 DOI：10.3969/j.issn.2095-5227.2015.10.021

时间：2015-06-16 10:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150616.1013.001.html

2015-04-30

国家自然科学基金项目(81372052)；解放军总医院苗圃基金(14KMM22)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81372052)

李晓，女，博士，主治医师，在站博士后。研究方向：干细胞治疗。Email: yueer1985@126.com

柴家科，博士生导师，主任医师，教授，所长。Email: cjk304@126.com